嗜热链球菌1636精氨酸代谢路径中关键酶基因转录水平变化研究

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嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是发酵乳制品工业中常见的组成菌株之一,其应用价值较高。关于嗜热链球菌营养需求及代谢机制等基础理论研究的缺失,使得国内嗜热链球菌的高密度培养依然处于起步阶段,要想从本质上解决这些技术问题,就必需从嗜热链球菌高密度培养所涉及的营养物质代谢的基础理论入手。对于乳酸菌来说,氨基酸是一种重要的营养成分,氨基酸代谢支撑着机体一系列生理生化活动,如胞内pH的控制、能量循环、体内氧化还原反应及抵抗外界不良环境的变化。  本研究利用单个遗漏法研究了嗜热链球菌KLDS1636的氨基酸消耗模式,发现精氨酸对嗜热链球菌生长有显著的促进作用,利用荧光定量PCR技术进一步研究不同精氨酸浓度下嗜热链球菌KLDS1636菌体内编码精氨酸代谢关键酶基因argH(精氨酸琥珀酸酶)、argJ(鸟氨酸乙酰转移酶)、carB(氨甲酰磷酸合成酶)、ADC(精氨酸脱羧酶)、speB(胍基丁胺酶)和ureC(脲酶基因)的表达水平,明晰嗜热链球菌KLDS1636生长过程中精氨酸的代谢,并确定适宜嗜热链球菌KLDS1636生长的精氨酸浓度范围。  研究结果表明精氨酸是维持嗜热链球菌KLDS1636正常生长的半必需氨基酸,虽然体内能够合成,但是远远不能满足菌体生长的需求。在各个生长阶段内嗜热链球菌1636对精氨酸的需要量不同,其中对数期需求量量最高,平均为6.75mmol gdw-1。  化学合成培养基中精氨酸浓度对嗜热链球菌KLDS1636的正常生长有显著地影响,其中嗜热链球菌1636生长的最适精氨酸浓度范围是0.6~1.2g/L,超出该浓度后,精氨酸能够显著阻碍菌体生长甚至产生毒害作用,培养基中糖氨酸浓度能够影响嗜热链球菌KLDS1636内必需氨基酸的消耗量。  精氨酸对嗜热链球菌KLDS1636的argH表达情况的影响与细菌所处的生长状态有关。与对照组相比,当菌体生长处于迟滞期,培养基中原始精氨酸浓度为0.2~0.6g/L时,嗜热链球菌KLDS1636的argH基因显著表达(P<0.05),分别上调了2.062倍、1.698倍和2.197倍;当菌体生长处于对数期时,嗜热链球菌1636的argH基因的表达则完全受到了精氨酸浓度的抑制,期间argH基因基本不表达;当菌体生长处于稳定期时,由于培养基中精氨酸浓度的显著降低,抑制作用被解除,嗜热链球菌KLDS1636的argH基因的表达水平显著上调(P<0.05),最高值为对照组的3.836倍。  研究发现嗜热链球菌KLDS1636的argJ基因在M17培养基中基本不表达,而在含有精氨酸的化学合成培养基(CDM)中被表达。CDM中嗜热链球菌的argJ基因的表达状况主要受到精氨酸浓度的影响,与对照组相比,在整个生长阶段内培养基中嗜热链球菌argJ基因相对表达水平较低。  嗜热链球菌KLDS1636的carB基因的表达状况与基因argH的表达状况相似,均受到细菌所处的生长阶段的影响,仅细菌进入对数生长期中后期时carB基因的表达水平显著升高(P<0.05),其中化学限定培养基中原始精氨酸含量为0.8g/L时,基因carB表达水平显著上调,是对照组的10.556倍,当培养基中原始精氨酸浓度超过0.8g/L时,carB基因出现显著下调。但是嗜热链球菌KLDS1636在其他生长状态下carB基因则处于抑制状态。  嗜热链球菌KLDS1636的ADC基因的表达水平主要受到细菌生长状态和培养基中精氨酸浓度的影响。在迟滞期和对数生长期时,ADC基因主要表达水平受到抑制而显著低于对照组,当嗜热链球菌KLDS1636进入稳定期后,基因ADC的表达水平开始上调,特别是原始精氨酸浓度超过0.6g/L时,基因ADC上调水平显著(P<0.05),其中最高上调了8.521倍。说明嗜热链球菌KLDS1636精氨酸分解代谢主要在稳定期进行,期间代谢生成多胺类物质和CO2,能够有效地抵御嗜热链球菌胞内低pH损伤。但是在各个生长阶段下嗜热链球菌1636的speB基因的表达水平则一直处于受抑制状态。  嗜热链球菌KLDS1636的ureC基因的表达水平主要受到生长状态的影响。当细菌生长处于迟滞期与对数期时,嗜热链球菌的基因ureC相对表达水平显著下调,均低于对照组水平。而一旦细菌生长进入稳定期后,基因ureC的表达水平开始显著上调,特别是在原始精氨酸浓度为0.2~1.0g/L的培养基中,基因ureC的表达水平显著上调,与对照组相比,最高值是对照组的12.641倍。此时脲酶的主要用于分解尿素产生CO2和NH3,降低培养基中pH值以抵御其菌体的伤害。  综上所述,培养基中高浓度的精氨酸对菌体生长有抑制(≥1.2g/L)和毒害作用(≥2.0g/L)。在培养初期,精氨酸主要用于菌体蛋白质的合成,而在对数期后期及稳定期时,精氨酸主要用于分解代谢产生碱性物质,抵御培养基中的酸胁迫。
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