第一章 小鼠创面修复中血管周细胞的来源探索一、研究背景和目的周细胞又名外膜细胞(adventitial cells)或Rouget细胞,由Eberth和Rouget两位科学家于19世纪70年代发现。近年来随着更多周细胞标记物的发现与应用,周细胞在血管发生、血管生成、血管成熟和塑型等方面的研究得以深入,其作用和意义也逐步引起关注。甚至一些研究认为,发现于新生血管芽的周细胞在血管生成早期发挥重要乃至主导作用。因此,研究血管周细胞在血管新生过程中的作用及机制具有重要意义。以往内皮细胞(Endothelial cells,ECs)一直被认为是血管新生过程中最具活性的细胞成分。但最近几年,已有研究对这一经典学说进行了修正。血管生成并不只依赖内皮细胞的侵入与增殖,更需要周细胞覆盖到血管芽处以维持血管的稳定性。当周细胞对血管内皮细胞包裹发生障碍时,血管新生和血管的改建均发生异常。国内、外许多研究已证实,创面愈合与周细胞密切相关,且增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、糖尿病血管改变等疾病均存在周细胞的异常改变。周细胞功能除具有血管稳定性、血管状态调节和维持局部和组织的自稳态(收缩能力和血管渗透性调节)、基质蛋白合成之外,还具有巨噬细胞样能力、免疫防御、干预凝血等一系列功能。其中最主要的就是参与调控血管的静止状态和新血管形成(包括血管形成发芽和血管生长),同时它和祖细胞一样有极大的可塑性潜能,形成成纤维细胞/肌成纤维细胞、脂肪前体细胞(preadipocytes)、软骨细胞、成骨细胞、牙本质细胞、血管平滑肌细胞等一系列细胞。尽管周细胞在形态学及功能上表现为多态性,其形态、分布密度和细胞标记物在不同组织内不尽相同。其来源于成体多潜能干细胞的观念已被广泛接受。周细胞研究的临床意义在于将来对血管的失稳定性和稳定性脉管形成的可控性治疗。但是其确切的来源和分化机制却仍不清楚。周细胞起源于胚胎血管形成(间充质干细胞,神经脊细胞和其他可能的来源)和在胚胎期和出生后血管新生(预先存在的周细胞,纤维细胞/肌成纤维细胞和循环中的祖细胞)。总之,目前认为周细胞是多细胞来源的,它的前体细胞可能来自骨髓造血干细胞(haematopoietic stem cells,HSCS)或骨髓间质细胞(Mesenchymal stem cells,MSCS)。Abe及其同事采用不同性别鼠骨髓移植到其它鼠创面,发现创面愈合过程中周细胞内含Y染色体,说明皮肤创面新生血管周细胞是骨髓来源的。Rajantie等的研究表明,周细胞表达造血干细胞的细胞标记(CD11b和CD45RO),提出周细胞可能来源于骨髓造血干细胞。进一步的研究发现,单独移植EGFP标记的骨髓造血干细胞之后的小鼠,其创面内新生血管周细胞表达EGFP标记物。但目前最为广泛接受的观点认为周细胞起源于间充质细胞。最新的研究认为间充质干细胞驻留在各种组织的血管周组织,而且这些细胞经鉴定是充当微血管的周细胞。如果如假设的那样,MSCs是周细胞的前体细胞(又称祖细胞),或许就可以解释目前无处不在的干细胞,以及它们在各种各样的修复中发挥的作用。他也给组织修复打开一个广阔的新天地。尽管有争论,但人们越来越接受血管周细胞与间充质干细胞的联系,所有这些仅仅是缺乏遗传学的证据,以表明周细胞分化为不同类型的细胞。间充质干细胞是多潜能的成体干细胞可在所有的组织中出现,作为专门的一类细胞(mural cells/pericytes)位于血管腔侧壁。原本来自骨髓基质的他们不仅为造血干细胞提供微环境的支持,而且能够分化成各种中胚层细胞系。总之,周细胞的来源及分化至今仍存在诸多争议。尽管骨髓是创面愈合过程中新生血管周细胞的确切来源,起源于骨髓内的多能干细胞有造血干细胞、间充质干细胞等多种细胞。但明确周细胞的来源,到底是造血干细胞,还是骨髓间充质干细胞?将是本项课题的研究基础,也是我们的研究内容之一。二、研究方法1.分离培养小鼠HSC、MSC,流式鉴定细胞表型;2.HSC细胞进行体外克隆培养,MSC细胞进行成脂成骨培养并染色鉴定;3.进行小鼠骨髓抑制实验,分为7Gy、8Gy、9Gy组,探索抑制效果,并重建造血,检测HSC、MSC体内功能;4.8Gy辐照,小鼠骨髓抑制后,RFP标记的HSC、EGFP标记的MSC尾静脉移植,并制备小鼠创面模型,活体成像观察细胞参与创面修复情况,免疫组化染色观察血管周细胞来源。三、研究结果1.分离培养了 HSC,细胞悬浮生长且有集落形成,流式检测鉴定lin-、sca1+、CD48-、CD34-标记为小鼠造血干细胞。MSC呈梭形,贴壁生长,流式检测鉴定 CD29+、CD44+、CD45-、CD34-。2.HSC可以分化为红系(BFU-E)、粒巨噬细胞系(CFU-GM)及粒红巨噬细胞系(CFU-GEMM)克隆样生长,MSC可以成脂、成骨分化。3.行PBS移植小鼠,7Gy组死亡率70%,8Gy、9Gy组全部死亡,行HSC移植后,9Gy组死亡1只,余均成活,据此后续实验将使用8Gy作为最佳照射剂量。14天后冰冻切片,未在皮肤、心、肝、肾等组织发现绿色荧光细胞。PBS移植组骨髓分离较少,HSC移植组分离完可见较多骨髓,进行克隆和普通培养,PBS移植组无克隆形成和细胞生长,HSC移植组有克隆形成和细胞生长。4.辐照小鼠创面周围,活体成像显示创面周围有较多红色荧光和极少量绿色荧光,免疫组化染色表明创面周围有大量RFP,EGFP无明显着色,同时RFP着色处,desmin同时着色,这提示血管周细胞来源于HSC。四、研究结论成功分离培养了小鼠HSC和MSC细胞,同时两种细胞具有干细胞潜能,两种细胞同时进行小鼠创面修复时,主要是HSC参与创面修复,MSC不参与,小鼠创面修复中周细胞主要是有HSC分化形成。第二章 交感神经调控骨髓内干细胞的研究一、研究背景和目的前一章的研究发现骨髓内的干细胞参与创面修复,骨髓周围分布交感神经,既往研究表明交感神经失能的小鼠,骨髓内的干细胞无法动员入血,这提示交感神经在在体水平调控了小鼠骨髓内的干细胞,但在离体水平交感神经如何调控骨髓内的干细胞,相关研究甚少。糖尿病是世界上发病率最高、对人类健康威胁最严重的疾病之一。其所引起的糖代谢紊乱,导致周围神经、微血管病变,继而引起一系列并发症,包括视网膜病变,糖尿病肾病和糖尿病足(慢性溃疡)及骨质疏松,已成为各国学者研究的重点。中国作为发展中国家经济增长迅速、生活方式的负向转变(如膳食脂肪摄入量的增加和体力活动的减少),加上老龄化问题日趋增加,使得糖尿病发病越来越多。糖尿病并发骨质疏松、难愈性创面,有研究表明这和骨髓内的干细胞失能相关。既往通过小鼠的研究表明,糖尿病小鼠骨髓内间充质干细胞增殖和分化潜能受损。骨髓间充质干细胞可以分化为骨、皮肤、软骨、肌肉等。这表明糖尿病骨质疏松和难愈性创面发生和骨髓间充质干细胞异常紧密相关。然而糖尿病至干细胞失能的发病机制仍未阐明。有研究表明,在血糖控制较好的患者中,骨质疏松发病时间较晚。这提示我们血糖可能在骨髓间充质干细胞失能中发挥了重要的调控作用。那么血糖升高是否可以直接导致骨髓内的干细胞凋亡呢,这有待我们阐明。骨髓的多种功能受交感神经调控。Mattia Albiero发现糖尿病患者骨髓周围交感神经受损,同时交感神经递质NE减少。NE是重要的交感神经末梢释放的儿茶酚胺类神经递质,具有调控多种细胞增殖、分化的作用。有研究发现NE调控大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和迁移。这些研究提示NE调控了骨髓内的干细胞,糖尿病所致交感神经失能可能影响了 NE对骨髓内干细胞的调控。然而NE在糖尿病中骨髓间充质干细胞的调控研究甚少。p-Akt、Bcl-2、Bax是经典的细胞凋亡通路,抑制p-Akt激活常导致细胞凋亡。Bcl-2升高可以保护细胞凋亡,Bax升高诱发细胞凋亡,Bcl2/Bax比值是标志细胞凋亡的特异性蛋白,caspase3是特异性诱发细胞凋亡的酶,活化后裂解形成cleaved-caspase3,是凋亡特异性的指标。因此我们希望探索离体水平交感神经递质在骨髓内两种干细胞HSC、MSC中的调控作用,并探讨p-Akt、Bcl-2、Bax在凋亡中的作用。二、研究方法1.利用CCK8检测10-6M、10-5M、104M的NE调控HSC、MSC细胞增殖情况;2.利用transwell和CCK8检测NE对HSC迁移的调控作用,利用细胞划痕检测NE对MSC迁移的调控作用;3.免疫组化检测NE调控HSC、MSC表达CD31、Desmin、a-SMA、K5的影响。4.利用Elisa、Tunel、流式检测高糖诱导的MSC凋亡情况,并检测NE对HG诱导的MSC凋亡的保护作用。5.应用WB检测NE保护高糖诱导的MSC中涉及的p-AKT、bcl-2、bax、cleaved-caspase3 的变化。三、研究结果1.CCK8检测增殖显示10-6M、10-5M均促进HSC增殖,10-5M促进作用最明显,10-4M显示抑制HSC增殖。CCK8检测增殖,10-6M、10-5M、促进MSC增殖,10-4M抑制增殖,10-5M促进作用最明显。10-5M被用于迁移、分化实验。2.10-5M NE促进HSC迁移。细胞划痕显示NE处理的MSC细胞划痕面积较大,这提示NE移植MSC迁移。3.免疫组化结果显示HSC、MSC中CD31、Desmin、a-SMA、K5表达上无明显差异,这提示NE对HSC、MSC表达CD31、Desmin、a-SMA、K5无影响。4.利用Elisa、Tunel、流式细胞术检测凋亡,发现细胞凋亡较4.5mM组高,这表明33mM的D-葡萄糖可以诱导MSC凋亡。在诱导凋亡的培养基中加入10-5MNE共同培养,发现在NE共同培养组,细胞凋亡明显降低,与4.5mM葡萄糖组无明显差异。这表明NE可以保护HG诱导的MSC凋亡。为了确认NE的保护作用。在进行HG和NE共培养MSC前,进行酚妥拉明(PH)和普莱洛尔(PR)阻断,发现PH阻断组凋亡升高,而PR阻断组凋亡仍然较低。这表明PH可以阻断NE保护HG诱导MSC凋亡的作用。5.利用 western blot 检测低糖、HG、HG+NE、NE+PH、NE+PR 培养的 MSC细胞 5 天时的 p-AKT、bcl-2、bax、cleaved-caspase3 的表达,HG 抑制 p-AKT、bcl-2 表达,增加 bax、cleaved-caspase3 的表达,NE可以逆转 HG对p-AKT、bcl-2、bax、cleaved-caspase3的表达的影响。进行PH、PR阻断NE作用后发现,PH可以阻断NE对p-AKT、bcl-2、bax、cleaved-caspase3表达的影响,PR无阻断作用。HG促使Bcl-2/bax表达明显降低,NE逆转了 HG的作用,PH阻断了 NE的作用,PR无明显影响。结果表明p-Akt信号通路参与了 NE保护HG诱导的MSC凋亡。四、研究结论NE促进HSC及MSC增殖,NE同样促进HSC迁移,但是抑制MSC的迁移,NE在HSC、MSC两种细胞向CD31、Desmin、K5、a-SMA的分化调控中无明显影响。D-glucose诱导了 MSC的凋亡,NE可以保护D-glucose的诱导作用,p-Akt、bcl-2信号通路参与了此过程。第三章 交感神经在骨髓源性干细胞参与创面修复中的调控作用一、研究背景和目的前面的研究表明骨髓内的干细胞参与创面修复并分化成血管周细胞,骨髓和创面存在时空上的距离,那么是骨髓内的干细胞通过什么途径动员到达创面的呢?有学者发现,交感神经系统的信号调控造血干细胞和祖细胞(Hematopoietic stem and progenitor cells,HSPC)从骨髓中释放。当药物性阻断肾上腺素神经传递,去甲肾上腺素信号控制G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor)诱导的造骨细胞抑制,骨的CXCL12(一种吸引造血干细胞和祖细胞的细胞因子,是骨髓特异性的壁龛)上调,使HSPC下调。因此,Cell上发表文章评论,认为这一新的神经系统调节轴可能控制着干细胞和局部微环境的关系。我们前面研究也发现骨髓内的干细胞在离体水平受交感神经的调控,那么在体水平中交感神经如何调控骨髓内的干细胞参与创面修复呢,相关研究报道甚少。因此我们希望进一步了解作为周细胞前体细胞的骨髓内各种细胞的壁龛构成,阐明在体条件下自主神经系统对创伤后动员内源性细胞向入血、归巢,并转化为周细胞参与修复的机制。二、研究方法1.6OHDA组、CTR组分别随机分成2组,一组为移植组,一组为非移植组,即6OHDA+移植组、60HDA非移植组、CTR+移植组、CTR非移植组。4组小鼠在进行交感失能造模后第6天,次日在进行创面制备前进行移植干细胞,移植组给予106个绿色荧光标记的HSC及106个红色荧光标记的MSC尾静脉注射,未移植组注射等体积的生理盐水。完成细胞移植后立即进行制备创面模型,在创面形成后立即拍照记录面积,记为0天,然后在1天、3天、5天、7天、9天拍照记录创面面积并取材。创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积2.分离培养小鼠皮肤成纤维细胞,细胞划痕检测NE对其迁移的作用。三、研究结果:1.交感失能的小鼠中,干细胞移植组小鼠创面愈合率加快。交感神经正常的小鼠中,干细胞移植组小鼠和未移植创面愈合无明显差异。交感失能小鼠进行干细胞移植较未失能小鼠干细胞移植创面愈合增快。不进行干细胞移植的交感失能小鼠和未失能小鼠创面愈合无明显差异。2.NE组成纤维细胞划痕较对照组大,提示NE抑制成纤维细胞迁移。四、研究结论交感神经确实参与了骨髓内干细胞入血参与创面修复,同时交感神经本身参与皮肤创面修复的调控,我们发现其调控了小鼠皮肤成纤维细胞的迁移。第四章 交感神经递质NE对毛发生长的调控一、研究背景和目的在前面进行交感神经对小鼠皮肤创面的研究中,我们意外的发现小鼠的毛发生长发生了改变,因此我们希望更进一步探索交感神经对小鼠毛发的调控作用。心理因素常可诱发脱毛,通过动物实验研究表明这和应激息息相关。应激是机体应对各种内外环境因素及社会、心理因素刺激时所出现的全身性非特异性适应反应。应激受下丘脑垂体肾上腺皮质轴和交感肾上腺髓质轴调控。皮肤是一个神经内分泌型器官,也是激素、神经递质及神经的直接靶器官,其表达促肾上腺皮质素释放激素受体、前阿黑皮素原及肾上腺素能受体等,也受下丘脑垂体肾上腺皮质轴和交感肾上腺髓质轴调控。既往研究表明,在收到应激后,下丘脑感受到应激信号,释放促肾上腺皮质素释放激素,促肾上腺皮质素释放激素与其受体结合,促进促肾上腺皮质激素的释放,促肾上腺皮质激素可以促进糖皮质激素的分泌和释放,糖皮质激素可以直接调控皮肤的毛发生长、皮肤角质形成细胞功能、皮肤免疫反应等。激活交感肾上腺髓质系统可以释放交感神经递质去甲肾上腺素、肾上腺素的释放。过去研究主要关注下丘脑垂体肾上腺皮质轴在皮肤中的调控作用,交感肾上腺髓质轴在皮肤中的作用研究甚少。因此本节我们主要关注交感肾上腺髓质轴在毛发生长中的调控作用。交感神经作为交感肾上腺髓质轴的一部分,通过分泌NE,调控创面的愈合。毛囊和血管周围都有交感神经分部。6OHDA是一种神经毒性药物,可选择性损毁交感神经末梢,但是无法穿过血脑屏障,所以是的是一种公认的应用于制备外周交感神经失能交感神经化学切除剂。因此我们希望利用60HDA进行化学性交感切除,研究交感神经在小鼠毛发改变中的作用。二、研究方法1.小鼠分成CTR组、60HDA组、PR组,每组30只小鼠。3-4周龄C57BL6小鼠90只,随机分成3组,PR组小鼠给予PR抑制β肾上腺素能受体。6OHDA组给予6OHDA进行交感失能模型制备。模型制备完成后,进行背部皮肤脱毛,诱导毛发进入生长期。诱导后1、3、5、7、9、14天取材并拍照,取材前2小鼠腹腔注射Brdu。Brdu注射剂量为0.2mg/g体重。2.免疫组化染色检测Ki67表达。3.进行小鼠皮肤组织培养,检测NE对其生长的调控。三、研究结果1.交感失能的小鼠毛发生长较PR组和对照组缓慢,皮肤厚度较对照组、PR组小鼠薄,毛囊长度短。2.Brdu和Ki67染色表明60HDA组小鼠角质形成细胞增殖较PR组和对照组少。3.皮肤培养中NE促进小鼠皮肤毛发生长,PH可以抑制NE促进作用,PR无抑制作用。四、研究结论交感神经通过调控角质形成细胞增殖影响小鼠毛发生长,并且是由交感神经递质NE介导的。