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细菌产生β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌最重要的耐药机制，当前最具临床意义的β-内酰胺酶是超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)和AmpC酶，造成细菌对第三代头孢菌素及其它β-内酰胺抗生素的高度耐药。而在阴沟肠杆菌中既存在AmpC酶的问题，又存在ESBLs的问题，耐药情况更为严重，给临床治疗造成了更大的难题。 ESBLs在Bush分类中属2be类酶，能分解第三代甚至第四代头孢菌素，可被β-内酰胺酶抑制剂所抑制。AmpC酶属Bush分类中的1类酶，能水解第三代头孢菌素，不被β-内酰胺酶抑制剂所抑制，编码基因为ampC基因，其表达往往可被β-内酰胺抗生素所诱导。AmpC酶与ESBLs这两种酶的性质不完全相同，分解的抗生素底物也不一样，产不同类型酶的细菌感染需选用不同抗菌药物，因此明确阴沟肠杆菌中产ESBLs、产AmpC酶及同时产两种酶的比例非常重要。目前美国临床实验室标准化委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS)尚无推荐的检测阴沟肠杆菌AmpC酶及ESBLs的方法，建立一种简便易行的检测阴沟肠杆菌AmpC酶及ESBLs的实验室方法，对指导临床用药有重要意义。 有关AmpC酶与ESBLs的问题是目前肠杆菌科细菌感染面临的最大问题，牵涉到阴沟肠杆菌、沙雷菌、摩根菌、弗劳地枸橼酸杆菌、肺炎克雷伯菌等许多菌株，其中最有代表性的是阴沟肠杆菌，且在临床上阴沟肠杆菌的感染日趋严重，其耐药性在国内远较国外严重。本研究以阴沟肠杆菌为主要菌种，对AmpC酶与ESBLs 浙江大学2003届博士学位论文在阴沟肠杆菌耐药中的作用，阴沟肠杆菌中ampC基因的表达调控及ESBLs的基因型进行深入研究。1．阴沟肠杆菌AmpC酶表型筛选方法的建立 建立一种新的简便易行的 AmpC酶的表型筛选方法，并对 144株阴沟肠杆菌进行检测，与三维试验结果比较，不符合的菌株进行等电聚焦试验和氯哩西林抑制试验＊ 株阴沟肠杆菌表型筛选结果显示高产 AmpC酶的菌株共有 3 5株，占 24．31％ （35／144）。表型筛选与三维试验相比总符合率为 89．58％（129／144）。2种方法检测结果相符的菌株129株，三维试验结果可疑的菌株10株，两种方法检测结果相反的菌株有5株。结果相反的5株菌株中，4株菌株的等电点条带均不能被氯哇西林抑制，另1株菌株等电点检测有5条条带，其中2条被氯哩西林抑制。提示表型筛选法检测AmpC酶结果可靠，方法简便，易于在临床实验室中推广应用。2．阴沟肠杆菌耐药及a呷C基因表达状况研究 采用纸片扩散法检测阴沟肠杆菌的药敏情况，聚合酶链反应法检测ampC基因，根据耐药表型对）W）C基因表达状况进行分析。结果显示1叩株阴沟肠杆菌对亚胺培南的敏感率高达98石1％，对头抱毗胎和头抱派酮／舒巴坦的敏感率分别为65．97％和 63．89％，但对阿莫西林／克拉维酸、头抱味辛等抗菌药物的敏感率较低。120株菌株ampC基因阳性（占83．33％），其中33株高水平表达（占27．50％），45株诱导表达（占37．50％人未表达或低水平表达的有42株（占35刀0％人诱导产AmpC酶的菌株除对阿莫西林／克拉维酸和头殉味辛敏感率低外，对其他抗菌药物的敏感率均在90％以上；而高产AmpC酶的菌株仅对亚胺培南和头抱毗sh的敏感率在85％以上，如合并产 ESBLS，则对头抱毗sh的敏感率下降。提示阴沟肠杆菌耐药状况严重，而ampC基因的表达状况不同，其耐药程度也不同，因此明确AmpC基因表达状况有助于临床抗菌药物的合理使用。3朋沟肠杆菌a呷R、a…基因突变与a呷C基因表达的研究 随机选取表型筛选为高产AmpC酶的阴沟肠杆菌6株和非高产的阴沟肠杆菌1株，检测 7株菌株对 11种抗菌药物的敏感性及所产酶的等电点，井通过 PCR法检 2 浙江大学2003届博士学位论文测 ampD和 a呷R基因，克隆测序。结果显示 6株表型筛选为高产 AmpC酶的菌株对第三代头泡菌素、复合制剂及单环酚胺类抗生素高度耐药，而另1株（41号）表型为非高产AmpC酶的菌株对第三代头抱菌素和氨曲南均敏感，且等电聚焦检测到pIS为 7．82和 6．75的两条条带，均不被氯哩西林所抑制。6株表型为高产AmPC酶的菌株，等电聚焦检狈到多条条带，其中… 为7．19，7．40，7＊8，8．10，8．30，9＊4等条带能被氯哩西林所抑制刀株菌株经pCR扩增，均获得423hp和849hp的。pD和 a…片段，与 41号菌株序列比较，显示 3株高产 AmpC酶菌株的 ampD基因存在氨基酸点突变，其突变位点变化为 His刁－Tyr，Pro62—Ser，Phe＊3～乃r，Try习5—Arg，Met of—Lys。ampR检测中提不氨基酸突变包括＊64－Val，Thr－106—lie，Gin－114一Asp，Ser－136一Pro，Ala二75一Thr，Ser－179一Cys，ATg－279～Cys，尤其是点突变Serf79—C