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研究背景和目的小细胞肺癌(SCLC)是一种恶性比较高的肺部肿瘤,占肺癌(Lung cancer)的15%左右。SCLC开始治疗时对放疗及化疗比较敏感,容易获得临床缓解,疾病的进展可得到控制,但是SCLC转移与复发比较常见,而且很容易获得多样耐药(MDR),是SCLC治疗的一大难题。本实验研究通过比较小细胞肺癌细胞株化疗敏感株及耐药株中具有差异表达的基因,对表达上调的基因Lnckcnq1ot1进行研究,探讨其对小细胞肺癌肿瘤细胞增殖、凋亡和对化疗药物耐药性的影响及相关调控机制。研究方法1、在测序对比敏感株及耐药株中LncRNAkcnq1ot1表达量;2、qPCR观察在两对细胞株(H69、H69AR;H446,H446DDP)中验证 Lnckcnq1ot1表达量;3、慢病毒转染小细胞肺癌耐药细胞株,干扰下调Lcnkcnq1ot1;4、在H69AR、H446DDP干扰下调Lcnkcnq1ot1后用CCK8法观察细胞增殖情况、用平板克隆法观察细胞团形成、用划痕实验观察划痕修复程度、用流式细胞检测技术观察下调后对耐药细胞株凋亡及周期的影响;5、在H69AR、H446DDP中干扰下调Lnckcnq1ot1,并分别用化疗药物阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、依托泊苷(VP-16)处理,并设置浓度梯度,在酶标仪下测得其OD值,并计算出三种药物的IC50,并用流式细胞检测技术检测对凋亡的影响;6、为了探寻LncRNA调控SCLC增殖、侵袭、凋亡及耐药机制,我们通过相关数据库软件及查得的相关文献推测,Lnckcnq1ot1可能与JAK2通路相关;7、qPCR 法观察 JAK2 在 H69、H446和H69AR、H446DDP 中 mRNA 表达量;8、免疫印迹法观察JAK2在H69、H446和H69AR、H446DDP中蛋白表达量;9、在H69AR、H446DDP干扰下调Lcnkcnq1ot1后,提取蛋白,免疫印迹法观察 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、BCL2、BAX 蛋白表达量;10、构建并用嘌呤霉素筛选出稳定下调Lnckcnq1ot1的H69AR,扩大培养后,接种移植到裸鼠的背部皮肤的下面,接种后定期测量皮下瘤的长径和短径,另外用EP方案给予裸鼠化疗药物,观察比较皮下瘤体积与重量。11、免疫组化法观察JAK2在裸鼠皮下肿瘤的蛋白表达。研究结果1、测序结果表明Lnckcnq1ot1在小细胞肺癌耐药株中高表达;2、qPCR方法结果显示lnckcnq1ot1在两对小细胞肺癌耐药株(H69AR,H446DDP)较敏感株(H69、H446)表达量高(P<0.05);3、筛选稳定下调Lnckcn1ot1的耐药细胞株H69AR、H446DDP;4、在H69AR、H446DDP下调lnckcnq1ot1后,体外功能实验表明其下调后抑制细胞增殖、迁移、侵袭,并把细胞阻滞在G1期,另外还促进细胞早期凋亡事件的发生(P<0.05)。5、体内动物实验观察比较裸鼠皮下瘤体积和重量得知,与对照组相比,干扰下调组裸鼠皮下瘤生长受到抑制(P<0.05);EP方案注射化疗药物3个周期后,干扰下调组裸鼠皮下瘤体积及重量低于对照组,说明其对化疗药物的敏感性增加(P<0.05)。6、qPCR及免疫印迹法分别观察JAK2的mRN和蛋白表达,结果表明,与H69、H446 mRNA及蛋白的表达量相比,JAK2在H69AR、H446DDP中的都比较高(P<0.05);7、在H69AR、H446DDP干扰下调Lnckcnq1ot1后,与对照组相比,干扰下调组中 JAK2 的 mRNA 表达量下降,而 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、BCL2蛋白表达量也下降,BAX蛋白表达量升高(P<0.05);8、免疫组化法观察,与对照组皮下瘤内JAK2的蛋白量相比,JAK2在干扰下调组中皮下瘤的蛋白表达量下降(P<0.05)。研究结论1、Lnckcnq1ot1与小细胞肺癌耐药细胞的增殖、侵袭及凋亡相关,下调Lnckcnq1ot1可抑制H69AR、H446DDP增殖、侵袭、迁移能力,并把细胞阻滞在G1期还可促进H69AR、H446DDP早期凋亡事件的发生;2、Lnckcnq1ot1与小细胞肺癌耐药相关,下调Lnckcnq1ot1可逆转H69AR、H446DDP对化疗药物的耐药;3、Lnckcnq1ot1 调控 H69AR、H446DDP 生物学行为与 JAK2/STAT3 通路相关。综上所述,我们了解到小细胞肺癌耐药机制的相关路径,即下调Lnckcnq1ot1可抑制小细胞肺癌的增殖、侵袭、迁移,并能把耐药细胞株的周期阻滞在G1期,从而影响细胞的生长及分裂,并促进细胞的早期凋亡事件的发生。另外,我们发现,下调Lnckcnq1ot1后,用ADM、DDP、VP-16药物处理耐药细胞,结果发现他们的IC50减小,说明降低了细胞的耐药性。我们又通过构建CDX动物模型,并给分组处理,观察测量皮下瘤的体积及重量,了解与对照组相比,下调组皮下瘤生长较慢,重量较轻,对下调组予以化疗药物,发现其对化疗药物的敏感性增加。我们还发现,Lnckcnq1ot1调控SCLC的这些生物学行为与JAK2/STAT3通路相关。