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普纳霉素(Pristinamycin,或称原始霉素)是由始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)产生的一种链阳性菌素类抗生素,由两种化学结构完全不同的化合物构成,即普纳霉素I(PI)(占30%,为非核糖体肽类抗生素)和普纳霉素II(PII)(占70%,为I型聚酮/非核糖体肽杂合型抗生素)。PI与PII之间具有很强的协同效应,同时使用的抗菌活性是单一组分的将近100倍。普纳霉素对G+细菌,特别是耐药菌,如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素的金黄色葡萄球菌和屎肠球菌(VREF)等有较好的抗菌活性,并且不易产生耐药性。普纳霉素经化学修饰得到的水溶性衍生物喹奴普汀/达福普汀已在欧美上市,用于治疗耐药菌引起的肺炎、菌血症与皮肤感染等。但目前国内企业缺乏优良的高产菌株,生产成本偏高,阻碍了该重要抗生素产品在国内的产业化进程。通过文献调研得知,影响普纳霉素高产的关键原因之一是:由于PI和PII之间存在较强的协同效应,它们在发酵培养基中的同时存在会对产生菌-始旋链霉菌自身产生严重的毒害作用,细菌生长受阻、生物量下降,最终导致普纳霉素发酵水平低下。因此,如能通过分别构建PI和PII的单一组分的高产菌株,将可以有效解决这一瓶颈问题。在本课题组之前的工作中,已经成功地利用代谢工程策略获得了单产PII的高产工程菌株,PII产量达到2.2 g/L,基本达到产业化要求。在此基础上,本研究工作主要专注于PI高产工程菌株的构建,出发菌株分别为企业提供的始旋链霉菌HCCB10218(同时产PI和PII)与HCCB10187(单产PI)。首先,以HCCB10218为出发菌株,运用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除PII生物合成基因簇中的2个聚酮合酶编码基因snaE1和snaE2,获得单产PI的工程菌株ΔPII。在此基础上,运用两种代谢工程策略,包括敲除途径特异性负调控基因papR3以及基于ΦC31整合酶位点特异性重组技术的PI生物合成基因簇的基因组整合表达(增加1个拷贝),构建了PI高产菌株。最终获得的工程菌株ΔPIIΔpapR3/PI的PI产量达到132mg/L,与出发菌株HCCB10218相比,PI产量提高了约2.4倍。这些结果表明,本研究中使用的代谢工程策略非常有效,为链霉菌的分子育种提供了方便的技术手段。另外,本文中还以PI单一组分高产菌株HCCB10187为出发菌株,同样运用以上两种代谢工程策略,构建了PI高产的工程菌株HCCB10189,其PI产量高达520 mg/L,与出发菌株10187相比,PI产量提高了94%。本研究获得的PI高产菌株的发酵水平仍然偏低,后续研究工作中还将拟组合其他代谢工程策略,如增加前体/辅因子供应、缺失竞争途径等,以及发酵培养基配方/工艺优化,以进一步提高PI发酵水平,从而促进普纳霉素的产业化进程。