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胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是中枢神经系统最常见、恶性程度最高的原发性脑肿瘤之一,其主要特征在于瘤细胞增殖快且抗凋亡能力强,患者预后差,中位生存期为11-15个月,5年生存率仅为9.8%。除手术切除外,放疗与化疗是临床治疗GBM的重要方法,其原理是诱导GBM细胞凋亡。例如,替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)诱导细胞毒性促进GBM细胞凋亡。放疗则通过诱导肿瘤细胞DNA损伤,导致细胞凋亡。在GBM中存在一群具有多谱系分化能力、自我更新能力强、能够抵抗凋亡的肿瘤细胞,称为胶质瘤干细胞(Glioma Stem Cells,GSCs)。找出在GSCs中特异表达的分子并研究其抵抗细胞凋亡的机制对GBM的治疗至关重要。斯钙素1(Stanniocalcin1,STC1)作为一种分泌型糖蛋白广泛表达于各种肿瘤。文献报道,STC1与GBM的预后有关。课题组前期实验证明,STC1维持GSCs干性。然而,尚不清楚STC1是否在GSCs抵抗凋亡中发挥作用。本文中,我们研究STC1在抑制GSCs凋亡中的功能和机制。实验结果如下:1.敲低STC1促进GSC死亡并导致GSC移植瘤生长缓慢通过慢病毒敲低STC1并研究GSCs表型的改变,台盼蓝染色检测两种细胞系的活力,结果显示,在GSC-5中,对照组的GSCs死亡率为5.0%,而敲低组1GSCs的死亡率为45.7%,比对照组增加40.7%;敲低组2 GSCs的死亡率为34.7%GSCs,比对照组增加29.7%(p<0.01)。在GSC-9中,对照组的GSCs死亡率为5.3%,敲低组1 GSCs死亡率为35.3%,比对照组增加30.0%(p<0.01);敲低组2 GSC死亡率为29.0%,比对照组增加23.7%(p<0.01)。实验结果提示,敲低STC1导致GSCs死亡增加。在体外构建成功敲低STC1的GSCs模型,将Mock组、shSTC1-1组、shSTC1-2组GSCs注射到NOD/SCID小鼠颅内,构建原位移植瘤模型。分别于第7、14、21天对NOD/SCID小鼠进行小动物核磁共振成像,结果显示,第7天时各组移植瘤体积无显著差别,而在第14天和第21天,Mock组的移植瘤体积明显大于shSTC1-1组与shSTC1-2组。以上结果显示敲除STC1有效抑制移植瘤生长。统计生存期发现,敲低STC1后延长荷瘤鼠生存期。2.敲低STC1导致GSCs线粒体肿胀并呈现碎片化通过电子显微镜观察敲低STC1对GSCs形态的影响,发现对照组线粒体主要呈长梭形、椭圆形,线粒体嵴紧密。而敲低组的GSCs线粒体形态与对照组显著不同,其线粒体长度变小,宽度增加(p<0.01),形状主要为圆形,线粒体嵴结构变短小且移至线粒体膜周边,线粒体基质电子密度减低,有些线粒体甚至呈现空泡状。此结果提示,敲低STC1导致GSCs线粒体肿胀。我们进一步通过TOM20标记线粒体,定量评估线粒体面积和周长。与对照组GSC-5相比,敲低组1与敲低组2的线粒体面积分别减少30.5%和15.3%(p<0.01),其周长分别减少16.7%和61.7%(p<0.01)。在GSC-9中,敲低STC1后的线粒体面积分别减少28.6%和39.3%(p<0.01);其周长分别减少31.3%和36.6%(p<0.01),提示敲低STC1导致GSCs线粒体碎片化。我们进而通过Western Blot检测线粒体碎片化相关分子的表达,结果发现,敲低STC1显著上调了MFF、FIS1等与线粒体碎片化相关分子的表达,促进线粒体裂变。已有文献表明,DRP1对于线粒体裂变至关重要,DRP1在丝氨酸616位点磷酸化促进线粒体裂变。我们发现,敲低STC1促进了DRP1丝氨酸616位点磷酸化,却对DRP1总蛋白表达无影响。综上,敲低STC1导致线粒体肿胀,促进线粒体发生裂变。3.敲低STC1导致GSCs产生ROS增加,且线粒体凋亡分子表达上调因线粒体受损可影响活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生,并与细胞凋亡密切相关。我们通过流式细胞术检测了ROS的生成,发现与对照组相比,敲低STC1后,ROS的产生增加(p<0.05)。通过Western Blot检测影响线粒体凋亡途径相关分子表达,结果发现,敲低STC1后显著上调了Bax的表达。Bax是一种关键的促凋亡分子,激活后从胞质到线粒体外膜(Mitochondria outer membrane,MOM)上,进一步在MOM上形成孔道,促进线粒体肿胀。以上结果表明,抑制STC1的表达,Bax的表达上调,促进线粒体肿胀与ROS、Cyt _c的释放,激活caspase级联通路,促进细胞凋亡。4.STC1表达与GBM预后呈负相关TCGA、Rembrandt和Gravendeel数据库分析结果显示,STC1 mRNA的表达在胶质瘤组织中显著高于瘤旁组织,且与胶质瘤级别呈正相关(p<0.01),与患者预后呈负相关(p<0.01)。此外,IDH1野生型GBM中STC1 mRNA的表达水平高于IDH1突变型GBM(p<0.05),间充质型GBM中STC1 mRNA的表达水平高于前神经元型和经典型GBM(p<0.01)。以上数据表明STC1高表达,患者预后更差。综上所述,本文研究结果提示敲低STC1促进线粒体裂变和肿胀,导致线粒体介导的凋亡途径的相关分子表达改变,促进GSC凋亡。在胶质瘤中,STC1是一个抗凋亡分子,可能是GBM治疗的潜在靶标之一。