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亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化(nitrite-dependent anaerobic methane oxidation, N-DAMO)是一种新发现的生物反应,它偶联了厌氧甲烷氧化与亚硝酸盐还原,是连接全球碳素循环及氮素循环的独特环节。催化N-DAMO反应的微生物是隶属于NC10门的Candidatus Methylomirabilis oxyfera (M. oxyfera)前期研究表明,N-DAMO菌富集过程中始终伴随着异养反硝化菌,两者之间的关系非常复杂,存在竞争也存在互助,然而,这方面的研究却未有报道。此外,N-DAMO研究的一个主要瓶颈是N-DAMO菌生长极其缓慢,其倍增时间长达14-25天,缩短富集周期迫在眉睫。已经报道的所有N-DAMO接种物都取自淡水生境,近来,在海洋生境中也检测到了N-DAMO菌的16S rRNA和pmoA基因序列,表明海洋生境中也存在N-DAMO菌,可能发生N-DAMO过程。本论文研究了淡水N-DAMO菌富集培养过程中N-DAMO菌与异养反硝化菌的菌群演替规律,为获得高纯、高活性的N-DAMO富集培养物提供指导;优化了淡水富集培养基,探索了pH控制策略,提出了适合N-DAMO菌生长的最优无机盐组合及pH调控策略,缩短了N-DAMO菌的富集培养周期；富集培养了海洋N-DAMO菌,拓宽了N-DAMO菌的来源范围。主要研究结果如下：1.探明了淡水N-DAMO菌富集培养过程中 N-DAMO菌与异养反硝化菌的菌群演替规律①以农田水稻土为接种物成功获得了淡水N-DAMO富集培养物。富集培养历经600天,呈现三个阶段：菌体水解阶段、活性迟滞阶段和活性提高阶段。从活性迟滞阶段开始,N-DAMO反应占主导地位。活性提高阶段,N-DAMO菌的比活性呈指数增加,而异养反硝化菌的比活性仅小幅增加,后期甚至略有下降。在N-DAMO菌富集培养过程中,N-DAMO菌得到了定向富集,异养反硝化菌被逐渐取代。②在接种物中发现了归属于NC10门的新类群即group E,其与M. oxyfera亲缘关系较远,16S rRNA基因序列相似度低于90%。富集培养6个月后此类细菌消失,仅富集得到了归属于group A的NC10门细菌。2.提出了适合N-DAMO菌生长的最优无机盐组合及pH调控策略①采用正交试验及酸碱滴定试验,优化研究了目前普遍采用的培养基中四种无机盐组分(CaCl2、MgSO4、KH2PO4 和 KHCO3),获得了适合N-DAMO菌生长的最优无机盐组合：0.3g L-1 CaCl2、0.2 g L-1 MgSO4、0.3 g L-1 KH2PO4和02gL-1KHCO3。②提出了控制N-DAMO培养基pH为中性的策略,培养基中KHCO3的浓度为0.2 g L-I时,用含有1%CO的混合气体(1% CO2,99% Ar)对培养基曝气,可方便有效地维持N-DAMO菌生长所需的中性环境。3.获得了海洋N-DAMO富集培养物并探索了富集培养物特性①以近岸沉积物为接种物成功获得了首个海洋N-DAMO富集培养物。富集培养期间,N-DAMO菌的比活性和数量均呈指数增长。海洋N-DAMO菌的倍增时间为33.6-38.4天,长于淡水N-DAMO菌的倍增时间(14-25天)。海洋N-DAMO菌的比细胞活性为0.15±0.07 fmol CH4 d-1 cell-1,与淡水N-DAMO菌的比细胞活性(009-0.34 fmol CH4 d-1 cell-1)相当。②探明了富集培养过程中N-DAMO菌的群落结构特征。与淡水N-DAMO富集培养过程类似,尽管在接种物中检测到了归属于group E的NC10门细菌,富集16个月后,仅得到归属于group A的NC10门细菌。表明归属于group A的NC10门细菌具有N-DAMO功能。③探索了基质(甲烷和亚硝酸盐)及盐度对海洋N-DAMO富集培养物的影响。海洋N-DAMO菌对甲烷和亚硝酸盐的表观亲和力常数均低于淡水N-DAMO菌对甲烷和亚硝酸盐的表观亲和力常数。此外,盐度对海洋N-DAMO富集培养物影响较大,适合海洋N-DAMO菌生长的最佳盐度为20.5%o。相对于高盐度,低盐度对海洋N-DAM O富集培养物造成的伤害更大。