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前言 骨科临床中，关节软骨损伤常见。关节软骨为透明软骨，其内部无血管、淋巴管、神经，其修复能力极其有限。对于关节软骨损伤，目前临床上仍缺乏确实有效的药物或非手术治疗手段。以往的外科治疗方法虽然有一定疗效，但其长期效果不佳，功能恢复不满意，很多患者最终不得不接受关节置换术。临床工作者试图用软骨或软骨细胞移植来治疗关节软骨损伤。最近，随着一项利用自体软骨细胞修复关节软骨的技术通过美国食品和药物管理局(FDA)的许可，使得软骨或软骨细胞移植成为治疗关节软骨损伤的新的希望。异种或异体软骨或软骨细胞可能导致免疫排斥反应，而自体软骨或软骨细胞又极其有限。如何在短期内获得大量的软骨细胞就成了亟待解决的根本问题。国内外学者对软骨细胞的培养作了大量的工作，但大多采用幼稚或较年轻的动物作为研究对象。机体内的关节软骨细胞以及骨髓基质干细胞随着年龄的增加而减少，而临床中关节软骨损伤的患者多为成年人或老年人。因此，需要一种与成年人或老年人相适应的软骨细胞的培养方法。 实验材料 (一)主要仪器 1．二氧化碳孵箱：BNA-311型日本ESPEC公司 2．超净工作台：SW-CJ-JED型苏州安泰空气净化公司 3．酶联免疫检测仪：美国MICROPLATE EL309 4．流式细胞仪：FACScan Becton Dickinson USA 5．多孔培养板：丹麦NUNCLON公司 6．倒置显微镜：OMMPUS CH型日本 OLYMPUS公司 7．天平：HCTD12BI型北京宣武天平厂 （二）主要试剂 1．DMEM培养基：GIBCO公司高糖型购于华美生物公司。配制方法：取粉末状培养基 1袋加到无菌烧瓶中，加人 HEPESZ．og，加人三蒸水950Inl，磁力搅拌使其溶解，用＊的NaOH和HCI调节PH值到7．2，加双蒸水到1000nd。过滤除菌，密闭后收藏在4℃冰箱，使用前加人胎牛血清到20％，青霉素500IU／l，链霉素500fig／Inl。 2．bFGF，rhFGF，Basic 25包装，冻于品。美国 Promega公司产品。稀释方法：向 bFGF冻干品中加人 11llirBS，分装到 5个即一Pendoif管中，为A液。取一管A液，加人PBS800ul，成为B液，浓度为 sn矿l。取200niB 液，加人 800ulPBS，成为 C液，浓度为 lug／M。 3．IGF一二，rhIGF－1，Basic 25包装，冻干品。美国 Promega公司产品。稀释方法：向 IGF－l冻干品中加人二 1llirBS，分装到 5个 EPPendoif管中，为 A液。取一管 A液，加人 PBS800ul，成为 B液，浓度为sn矿Inl。取200niB液，加人 800ulPBS，成为 C液，浓度为 inglrnl。 4．pl 10mg包装，美国 Sigrn。公司，购于华美生物公司。配制方法：将 smgPI溶于 10rnll．12％拘檬酸钠溶液中，浓度为 500fig／Inl，4℃避光保存。 5．MTh美国 Sipoa公司产品。 6．RNase，250mn包装，美国Sina公司，购于华美生物公司。用l．12％拘檬酸钠配成lin砂Inl的溶液，加热到75℃3分钟，灭活DNA酶。再稀释到浓度为100fig／rnl。 7．胎牛血清，北京军区兽医防治研究所 8．11型胶原抗体小鼠抗人单克隆抗体，与免有交叉。美国 ·2·Siglna公司，购于沈阳邦定公司。 0．胰蛋白酶美国GIBCO公司购于华美公司。向250mg胰蛋白酶中加人100rlilPBS，磁力搅拌溶解后，过滤除菌后，－20t冰箱保存，使用前复温。冰箱保存，使用前复温。 （三）实验动物 24－48月龄新西兰大白兔，购于医大二院动物室。 实验方法 无菌条件下切取成年兔关节软骨，切成碎片后，依次用透明质酸酶、胰蛋白酶、胶原酶消化。冲洗离心后，用含FBS的DMEM培养。门＊ry检测细胞成活情况：将原代软骨细胞接种到96孔板中，按设计加人不同浓度的hFGF与mF－1，用DMEM培养基培养。24／8J2小时后，向不同的培养板中加人Mry，用酶联免疫检测仪检测光密度，细胞成活数与光密度成正比，通过比较光密度来比较细胞成活数。门）细胞计数，检测增殖倍数：将原代软骨细胞接种于6孔板中，按设计加人不同浓度的生长因子，用DMEM培养基培养，当一孔细胞达到汇合状态时，将各孔细胞同时用胰酶消化，计数后传代。传四代后，计算各组细胞的总增殖倍数。瞩）流式细胞仪检测细胞增殖情况：将第一代软骨细胞接种于24孔板中，按实验设计施加 hFGF与mF－l，培养 14天后，加入碘化异丙染色后流式细胞仪检测。 实验结果 流式细胞仪结果： MTh结果显示加人不同浓度的bFGF与不同浓度IGF－I的各组细胞在24小时，48小时，72小时的OD值与对照组均有明显 ·3·差异，说明不同浓度的hFGF与IGF－I均可促进成熟兔软骨细胞增殖，两种因子都以浓度为50 n矿l时作用最强pD值最高。高于或低于此浓度，其OD值均下降，说明这两种因子的促增殖作用均与浓度有关。同时加人 50 nghalllGF－I与 50 ＂g／theFGF的光密度高于单独加人同浓度的这两种因子的光密度之和。?