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微生物的多样性及其代谢产物的多样性是发现药物先导化合物的重要基础。本文从微生物菌株培养条件多样性获得代谢产物多样性和从不同植物来源的内生菌中寻找次级代谢产物多样性两方面入手,开展微生物抗肿瘤活性次级代谢产物的研究。研究内容包括:对已知产生新骨架细胞松弛素的活性菌株曲丽穗霉(Spicaria elegans) KLA03,进行改变培养条件和加入酶抑制剂的OSMAC (One Strain-Many Compounds)研究,旨在激活该菌株潜在的沉默代谢途径获得多种新类似物;同时从植物内生特殊环境中发现内生菌株,对其多样性的次级代谢产物进行了系统研究;并对获得的活化合物进行抗肿瘤活性评价及其构效关系研究。首先,本实验室在前期工作中发现KLA03活性菌株能够产生系列新骨架开链细胞松弛素化合物,该类化合物具有显著的细胞毒活性和酪氨酸激酶抑制活性,具有抗肿瘤药物先导结构的优势。本论文通过对改变培养条件和加入酶抑制剂两个方面,对菌株KLA03进行了OSMAC研究。研究结果发现,在一种新的豆粉培养基和摇床培养方式下菌株KLA03代谢产物发生了很大的变化,不再利用苯丙氨酸合成cytochalasins,而是主要利用亮氨酸合成了aspochalasins型的细胞松弛素(1-17),其中有9个是新化合物(1-9),发现了同一菌株同时具有合成cytochalasins和aspochalasins两种结构类型的细胞松弛素的能力;同时,在一种高糖培养基中菌株还产生了新的异苯并呋喃二聚体(26和27)和骨架新颖的aspochalasins与异苯并呋喃的混合二聚体(28和29),通过推测它们的可能生合成过程,提出了aspochalasins类化合物的C-19,20位不饱和酮片段发生自由基加成反应的可能性;加入P450氧化酶抑制剂(美替拉酮),抑制了cytochalasinsZ7和Z9在生合成过程中C-6,7为的氧化过程,生成了新的脱氧的cytochalasins (30和31)。利用X-ray单晶衍射结合化学反应的方法(Mosher法等),确定了开环cytochalasins和aspochalasins类细胞松弛素的绝对构型,验证了cytochalasins和aspochalasins在生合成过程中的同源性。其次,从不同来源的红树林样品中分离纯化出内生真菌42株,根际土壤真菌96株,通过以P388细胞为模型共筛选出活性真菌17株。综合考虑其活性和代谢产物的HPLC指纹图谱和TLC分析结果,最终确定1株产细胞松弛素的红树林内生真菌W-6和另外5株真菌(GQ-7,W-8,JP-1,HK-03-6,HK-16-4)作为进一步化学研究的目标菌株。此外,对2株肉苁蓉内生菌(CF005和AC-6)神经保护活性次级代谢产物进行了系统研究。经过大发酵,从菌株W-6中分离到12个化合物,其中包含6个新的细胞松弛素(32-37)和2个新的三肽类化合物(38和39)。从另外7株内生菌中共分离到化合物78个,其中新化合物18个,新化合物类型包括6个tetramic acids (45-50),1个橘霉素二聚体(51),3个酚醌类化合物(59-61),3个倍半萜及其衍生物(74-76),2个异苯并呋喃非对应异构体(82和83),和3个其他类化合物(77,95,100)。以不同肿瘤细胞株为模型,用SRB法或MTT法对分离得到的29个细胞松弛素类化合物的抗肿瘤活性进行了评价,新发现了4个cytochalasins (32, 33, 35, 39)对A549细胞具有不同程度的抑制活性,IC50值分别为19.6, 5.6, 17.4, 7.9μM,结合我们实验室所分离到的其他结构的cytochalasins活性评价结果显示,C-6,7位环氧结构和C-20位烯醇酯片段是cytochalasins具备高活性的必要的两个基团。对于中等活性的cytochalasins,C-17位的α,β不饱和酮是其活性的关键基团,并且苯基部分的羟基取代使其活性降低。全面评价了17个具有亮氨酸残基的细胞松弛素(aspochalasins)的细胞毒活性,充分证明C-19, 20位的α,β-不饱和酮片段是该类化合物的活性必须基团。还评价了6个新的tetramic acids (45-50)对四种肿瘤细胞的细胞毒活性,确定了C-8位的饱和脂肪直链是活性的关键基团,并且其母核的5S构型能够使其活性明显增强。发现化合物59对P388细胞具有较强的抑制活性,IC50达到1.38μM。此外,评价了肉苁蓉内生放线菌AC-6的所有代谢产物(108-122)对GPR12蛋白的亲和性,发现化合物109可能是其配体。还发现化合物100在0.1 nM浓度下对过氧化氢损伤的神经细胞具有明显的保护性。总之,本文通过对已知菌株KLA03进行OSMAC的研究,和8株植物内生菌多样性次级代谢产物的研究,共得到122个化合物单体,其中新化合物42个,包括19个新的细胞松弛素类化合物。首次利用培养条件的改变在同一株菌中激活了aspochalasins和cytochalasins两种细胞松弛素的生合成途径,并通过对这两种细胞松弛素绝对构型的确定验证了它们生合成过程中的同源性。评价了细胞松弛素和其它部分新化合物的生物活性。初步阐明了它们的构效关系。既为抗肿瘤新药提供了新的可能先导结构,也为今后‘OSMAC’策略在微生物天然产物中的应用和推广提供了一定的实验依据。