金边红苞凤梨（Ananas comosus var.bracteatus）以其独特的金边嵌合性状,叶花果兼赏,成为重要的新型观赏植物,既可用作盆栽观赏、植物造景,也可用作鲜切花。金边红苞凤梨嵌合叶片由边缘白化组织及中央绿色组织构成,是研究叶片白化突变机理的理想材料;同时叶嵌合体也是研究叶绿素合成积累、叶绿体发育、光合作用和植物发育的优异材料。深入研究嵌合叶片金边形成原因,对揭示叶色嵌合体形成机理、培育叶色嵌合新品种具有重要意义。叶绿素和血红素是植物四吡咯化合物合成代谢途径的2个竞争分支,对植物的光合作用、形态建成和生长发育具有重要作用。本研究以金边红苞凤梨嵌合叶片的中央绿色组织和边缘白化组织为材料,分析了绿色和白化组织四吡咯化合物合成代谢之间的差异,并结合转录组学、蛋白组学测序结果,筛选出红苞凤梨谷氨酰t RNA还原酶基因（Glutamyl-t RNA reductase gene,AbHemA2）是红苞凤梨嵌合叶片白化失绿和维持叶片四吡咯化合物合成代谢稳定的关键基因。克隆了AbHemA2基因序列,并通过RNAi遗传转化进行功能验证;结合外源5-氨基酮戊酸（5-Aminolevulinic acid,ALA）饲喂对红苞凤梨四吡咯化合物合成途径的影响,探讨了AbHemA2基因在金边红苞凤梨嵌合叶片叶细胞失绿白化和叶绿素、血红素合成代谢调控中的作用。所得研究结果如下:1金边红苞凤梨嵌合叶片绿、白组织之间叶绿素含量差异极显著,两者相差约25倍。而ALA含量没有显著差异,绿色组织略高于白色组织。与之相反的是白化组织中血红素含量显著高于绿色组织,Mg2+、Fe2+含量也显著高于绿色组织。酶活检测显示,白化组织中谷氨酰t RNA还原酶（Glutamyl-t RNA reductase,GluTR）活性上调,但差异不显著。嵌合叶片三个发育阶段（S1、S2、S3）实时荧光定量PCR（Reverse transcription quantitative real-time PCR,RT-q PCR）分析表明,白色组织中AbHemA2基因表达上调,与课题组前期转录组及蛋白组测序结果一致。说明白化叶片白色组织中高的AbHemA2表达水平、GluTR酶活性和Fe2+浓度促进了血红素的合成积累,而血红素的高水平积累对叶绿素的合成产生竞争抑制,从而促进了叶片的白化失绿。2 ALA是叶绿素合成通路第一个前体物质,由AbHemA2基因编码的GluTR催化谷氨酰t RNA所得。金边红苞凤梨叶片内源ALA含量随着外源ALA浓度（0、100、200mg/L）的升高而显著升高。适度水平的（100mg/L）外源ALA饲喂能显著提高内源ALA含量,从而显著提升AbHemA2基因表达水平,进而提高GluTR酶活性,促进血红素合成,但叶绿素合成受阻,这与金边红苞凤梨嵌合叶片白化组织的情况一致;而过高水平（200mg/L）的外源ALA饲喂则会导致内源ALA过量积累,从而抑制AbHemA2基因的表达,降低GluTR酶活,抑制血红素合成,进而促进叶绿素合成,这与金边红苞凤梨嵌合叶片绿色组织情况一致。说明ALA含量能调控AbHemA2基因的表达和四吡咯化合物合成代谢流向叶绿素和血红素的分支定向,从而决定叶绿素和血红素的含量和相对比例,影响叶片颜色。3在金边红苞凤梨基因组中鉴定到1个HemA基因,克隆得到其c DNA全长为1981bp,包含一个长度为1617bp的开放阅读窗（ORF）,编码538个氨基酸,根据基因注释命名为AbHemA2。AbHemA2具有HemA家族共有的N＿terminal domain、C＿terminal domain以及NADPH结合域,与菠萝As HemA2同源性最高,与其他物种HemA2蛋白同源性均在75%以上,是一个物种间具有较高保守性的基因。4构建pTCK303-AbHemA2-RNAi干扰载体并以农杆菌介导转化红苞凤梨白化愈伤及烟草叶片,用含潮霉素（Hygromycin B）的培养基筛选后获得抗Hyg的烟草及红苞凤梨植株。经PCR鉴定检测后,得到7株转基因烟草,红苞凤梨抗性苗中暂未检测到转基因植株。q RT-PCR检测烟草转基因株系中AbHemA2基因的表达量均显著低于野生型烟草,同时转基因植株的GluTR酶活性、叶绿素含量、血红素含量均显著下调。转基因烟草叶色黄化,叶片下垂,长势较弱,且ALA含量显著高于野生型烟草。说明当AbHemA2表达受到干扰时,GluTR酶活性下降,但由于叶绿素、血红素合成的抑制,ALA相对积累。同时也由于叶绿素和血红素的缺乏,植株出现黄化表型。