研究背景及目的前列腺癌目前是男性常见的恶性肿瘤,居西方国家男性所有恶性肿瘤发病率的第二位,死亡率的首位。而在美国,前列腺癌的发病率则位居男性所有肿瘤的首位,死亡率仅次于肺癌。我国前列腺癌的发病率虽比西方国家低很多,但随着人口的老龄化、生活水平的提高以及医疗的改善呈现明显上升的趋势,对我国男性的健康已经有很大的影响。Huggins和Hodges最早发现前列腺癌存在激素依赖性,提出了雄激素去势治疗方法(androgen deprivation therapy, ADT)临床上取得了很好的效果。但在阻断雄激素之后的平均约18个月左右,很大部分前列腺癌将发展为雄激素非依赖性生长。然而对于雄激素非依赖性前列腺癌(androgen-independent prostate cancer, AIPC)目前还没有标准且有效的治疗方案,最终将导致病情恶化,治疗失效。到目前为止,前列腺癌发生雄激素非依赖性改变的机制还未完全清楚。目前认为肿瘤是细胞周期障碍性或(和)凋亡机制障碍性疾病,因此对细胞周期和细胞凋亡的研究是当前恶性肿瘤的两大研究热点。我们在以往的研究中已经发现细胞周期对凋亡相关基因有明显的影响,随着近年来对细胞周期的研究取得一些突破性进展,人们对肿癌是一类细胞周期疾病已有很好的认识。细胞周期调控紊乱、细胞凋亡失控、细胞增殖的改变是肿瘤组织最明显的特点。细胞周期紊乱可以使几乎所有肿瘤细胞的生物学特征改变呈失控性生长。很多癌基因和抑癌基因可以直接调控细胞周期,或者本身就是作为主要成分调控细胞周期机制的,他们的突变可以使细胞周期失控,从而使细胞周期的开始、运行和终止发生异常,并使细胞获得以凋亡过少、增殖过多为主要形式的失控性生长特征。已知Bcl-2家族是细胞凋亡发生和调控机制的重要环节,Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的主要成员,其中Bcl-2是与前列腺癌发生和发展,从雄激素依赖性转变为雄激素非依赖性过程关系密切的重要抗凋亡基因,而caspase-3是caspase家族中的主要成员,是细胞凋亡过程中激活的关键激酶,同时也是细胞凋亡过程的主要效应因子。Marcel li等学者研究发现前列腺癌细胞(L ncap)凋亡与胱氨酸蛋白酶家族里成员Caspase-3激活有关,而且胱氨酸抑制剂也能够消除其诱导作用,因此提示Caspase家族可能与前列腺癌细胞凋亡关系密切。RNA干扰(RNAi)是利用小RNA(包括小干扰RNA即：siRNA)序列抑制特定基因信号的过程,直到目前还未发现哺乳动物有内源性表达的siRNA。若能将人工合成的具有特定序列的siRNA导入肿瘤细胞内,有可能引起具有同源序列基因的mRNA降解,从而有效地抑制该基因的表达,影响肿瘤的生物学行为。因此,近年来RNAi技术的发展为前列腺癌治疗的研究提供了一种新思路。最近,韩赵东等应用双向电泳及质谱分析的方法鉴定出2566种肿瘤蛋白,并通过生物信息学分析出在前列腺癌中有60个差异性蛋白,其中37个表达为上调,而23个表达为下调。而其中有14种基因及其蛋白产物(ACLY, CAPG, GSTM3, GSTP1, HNRNPL, IMPDH2, KRT15, MCCC2, MSN, MYL9, PYGB, SERPINB5, TRAP1and VCL)在前列腺癌中表达明显差异。核不均一蛋白L(hnRNPL)属ThnRNPs家族成员之一,String分析显示hnRNP L与hnRNPs家族数个成员是功能伴侣(function partner), Pubgene分析提示hnRNP L与凋亡、死亡和生长的细胞生物学进程相关。同时我们前期的研究也已经证实了HnRNPL与生精细胞的增值和凋亡关系密切。hnRNPs家族中的HnRNPK已被报道跟前列腺癌有着密切关系,并参与前列腺癌的增值、分化及凋亡过程。然而hnRNP L是否跟前列腺癌的发生、发展有着密切的关系呢?目前尚未有此相关的文献报道。因此,本课题的设计思路：先用免疫组化和Western Blot检测HnRNP L蛋白在正常前列腺组织和前列腺癌中的表达,并通过沉默(或过表达)HnRNP L后观察前列腺癌细胞的生物学行为如生长增殖、侵袭、迁移及凋亡等的影响,并在此基础上,探导HnRNP L蛋白可能参与的前列腺癌细胞运动信号通路,揭示HnRNP L参与前列腺癌发病进展的新机制,同时为前列腺癌的治疗提供新的靶点。方法：1.运用免疫组化和Western Blot检测HHnRNP L在正常前列腺组织和前列腺癌中的表达。取一组织芯片包括81例前列腺增生组织和99例前列腺癌组织(其中Gleason评分2-4分2例,5-6分24例,7-10分73例),根据免疫组化试剂盒和抗体浓度要求进行免疫组化,检测其HnRNP L蛋白的表达情况,并统计分析其阳性率及与肿瘤分化程度,病理分级和临床分期的相关性。同时通过培养正常前列腺上皮细胞(RWPE-1细胞)和激素非依赖性前列腺癌细胞(PC3细胞)及激素依赖性前列腺癌细胞(Lncap细胞),提取各种细胞的总蛋白,并通过蛋白质印迹(Western Blot)检测HnRNP L蛋白在三种细胞中的表达。2. HnRNP L基因的有效siRNA序列的筛选及效果检测针对人类HnRNP L基因mRNA序列设计并化学合成三条siRNA及两条阴性对照序列,在siRNA转染后48小时用western-blotting检测PC3细胞HnRNP L蛋白表达水平的变化。3. siRNA沉默HnRNP L基因对RWPE-1细胞、Lncap细胞、PC3细胞生物学行为的影响实验分为第一组(RWPE-1组、RWPE-1+HnRNP L-siRNA组),第二组(Lncap组、Lncap+HnRNP L-siRNA组),第三组(PC3组、PC3+HnRNP L-siRNA组)；采用脂质体包裹已被证实有效的HnRNP L-siRNA转染这三种细胞；用CCK-8法测各组细胞生长增殖情况；划痕实验法观察细胞的迁移能力；Tran swell法观察细胞的侵袭力。4. siRNA沉默HnRNP L基因对Lncap细胞、PC3细胞Bcl-2、caspase-3基因表达的影响在Lncap细胞和PC3细胞中,用筛选出的证实了有效的siRNA沉默HnRNP L蛋白48小时后,采用western blot检测对照组和处理组中Bcl-2、caspase-3表达的变化。结果：1.免疫组织化学结果显示HnRNP L蛋白在BPH和PCa阳性表达率分别为29.7(24/81),84.9%(84/99)(P<0.01)；在Gleason评分2-6分组阳性表达率为61.53%(16/26),Gleason评分7-10分组阳性表达率为93.15%(68/73)(P(0.05)；在临床(A+B期)阳性表达率为83.87%(78/93),(C+D组)阳性表达率为100%(6/6)(p>0.05)；HnRNP L表达与前列腺癌病理分级正相关,与临床分期无关。Western Blot检测发现HnRNP L蛋白在PC3细胞中表达最高,其次为Lncap细胞,表达最低的为正常前列腺上皮细胞(RWPE-1细胞)。2.三条序歹HnRNP L-siRNA转染PC3细胞后48小时western blot检钡HnRNP L蛋白水平,结果显示序列3十扰效果最好,蛋白水平下降了70%以上,达到后续实验干扰的效果。3.瞬时下调HnRNP L表达后,RWPE-1细胞增殖能力与对照组相比显著下降,差异有统计学意义(F=315.064,P=0.000),不同的时间点对RWPE-1细胞的增殖影响显著(F=431.920,P=0.000),各时间点组与处理组间交互效应显著(F=21.213,P=-0.000),划痕实验可见与对照组细胞的迁移力有显著差异(P(0.01),Transwell可见与对照组细胞的穿透力有显著差异(P<0.01);Lncap细胞增殖能力与对照组相比显著下降,差异有统计学意义(F=568.718,P=0.000),不同时间点对ncap细胞的增值影响显著(F=1543.436, P=0.000),各时间点组与处理组间交互效应显著(F=51.226,P=0.000),划痕实验可见与对照组细胞的迁移力有显著差异(P<0.01),Transwell可见与对照组细胞的侵袭力有显著差异(P(0.01)；PC3细胞增殖能力与对照组相比显著下降,差异有统计学意义(F=668.116,P=0.000),不同的时间点对PC3细胞的增殖影响显著(F=2871.830,P=0.000),各时间点组与处理组间交互效应显著(F=123.353,P=0.000),划痕实验可见与对照组细胞的迁移力有显著差异(P<0.01),Transwell可见与对照组细胞的侵袭力有显著差异(P<0.01).4.下调HnRNP L表达后,Lncap细胞和PC3细胞中Bcl-2的表达量下降,而caspase-3的表达量升高。结论：1. HnRNP L蛋白在正常前列腺和前列腺癌中的表达有差异,在肿瘤中为高表达,并且HnRNP L表达与前列腺癌病理分级正相关,与临床分期无关。2.三条干扰序列中,3号干扰序列在干扰48小时后蛋白水平下降效果最好,因此确定用3号HnRNP L-siRNA来进行后续研究。3.沉默HnRNP L基因抑制了RWPE-1细胞、Lncap细胞及PC3细胞的生长；沉默HnRNP L基因降低了RWPE-1细胞、Lncap细胞及PC3细胞的迁移力和侵袭力。4.下调HnRNP L蛋白后,促进前列腺癌细胞的凋亡,抑制肿瘤的生长。