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第一部分TOPK/PTEN/Akt通路在七氟烷后处理减轻心肌缺血再灌注损伤中的作用目的研究七氟烷后处理对心肌缺血再灌注或缺氧再复氧损伤的作用,并探讨是否与TOPK/PTEN/Akt信号通路有关。方法雄性C57BL/6小鼠,15-16周龄,随机分为五组：①假手术组(Sham);②缺血再灌注损伤组(IR)；③七氟烷后处理组(Sevo-PostC);④七氟烷后处理+LY294002组(Sevo-PostC+LY);⑤七氟烷后处理+HI TOPK-032组(Sevo-PostC+HI)。建立小鼠心肌缺血再灌注损伤模型,即结扎冠脉左前降支后心肌缺血45分钟并再灌注2小时,持续监测小鼠血压及心率。H9c2细胞使用含1000 mg/L葡萄糖的胎牛血清培养基培养3天,随后进行试验,同样随机分为五组：①对照组(Control);②缺氧再复氧损伤组(HR);③七氟烷后处理组(Sevo-PostC);④七氟烷后处理+LY294002组(Sevo-PostC+LY);⑤七氟烷后处理+HI TOPK-032组(Sevo-PostC+HI)。H9c2细胞建立缺氧再复氧模型即细胞缺氧3小时再复氧6小时。TTC染色评估心肌梗死,MTT法评估细胞活性,ELISA法检测肌酸激酶同工酶(CK-MB)和比色法检测乳酸脱氢酶(LD H)的浓度,TUNEL法评估心肌细胞凋亡状况,Western Blot检测心肌组织或细胞蛋白TOPK、PTEN、Akt及其磷酸化水平。结果在动物水平,七氟烷后处理减轻了心肌缺血再灌注的损伤,主要表现为提高小鼠再灌注末期平均动脉压、减少心肌梗死面积、降低心肌酶CK-MB和LDH水平及减少心肌细胞的凋亡(与IR组比较,P<0.05)。在细胞水平,七氟烷后处理提高了缺氧再复氧后的细胞活性,并减少了LDH的释放(与HR组比较,P<0.05)。然而,TOPK或PI3K抑制剂可消除七氟烷后处理的心肌保护作用(P<0.05)。与IR或HR组比较,七氟烷后处理可明显升高蛋白TOPK、PTEN及Akt的磷酸化水平(P<0.05)。七氟烷后处理给予TOPK抑制剂后降低了PTEN及Akt的磷酸化水平(Sevo-PostC组与Sevo-PostC+HI组,P<0.05),而给予PI3K抑制剂后仅减少了Akt的磷酸化水平(Sevo-PostC组与Sevo-PostC+LY组,P<0.05)。结论七氟烷后处理能有效减轻小鼠心肌缺血再灌注的损伤,且该作用可能与TOPK/PTEN/Akt通路激活有关。第二部分TOPK/PTEN/Akt通路受损在糖尿病消除七氟烷后处理心肌保护中的作用目的研究糖尿病对七氟烷后处理心肌保护作用的影响,并探讨是否与TOPK/PTEN/Akt信号通路受损有关。方法7-8周龄雄性C57BL/6小鼠采用连续腹腔注射40mg/kg链脲佐菌素5天建立糖尿病模型,记录小鼠的饮食饮水量、体重及血糖变化。8周后,糖尿病和非糖尿病小鼠随机分为四组：①缺血再灌注损伤组(IR);②七氟烷后处理组(Sevo-PostC);③糖尿病缺血再灌注损伤组(Diabetic+IR);④糖尿病七氟烷后处理组(Diabetic +Sevo-PostC)。H9c2细胞使用含1000 mg/L或4500 mg/L葡萄糖的胎牛血清培养基培养3天,随后进行试验分组：①缺氧再复氧组(HR);②七氟烷后处理组(Sevo-PostC);③高糖缺氧再复氧组(HG+HR)④高糖七氟烷后处理组(HG+Sevo-PostC);⑤载体腺病毒+高糖缺氧再复氧组(Ad-vector+HG+HR);⑥载体腺病毒+高糖七氟烷后处理组(Ad-vector+HG+Sevo-PostC);⑦过表达TOPK腺病毒+高糖缺氧再复氧组(Ad-TOPK+HG+HR);⑧过表达TOPK腺病毒+高糖七氟烷后处理组(Ad-TOPK+HG+Sevo-PostC)。TTC染色评估心肌梗死,MTT法检测细胞活性,ELISA法检测肌酸激酶同工酶(CK-MB),比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)及丙二醛(MDA),羟胺法检测总的超氧化物歧化酶(SOD)水平,TUNEL法评估心肌细胞凋亡状况,ROS探针评估心肌细胞的氧化应激水平,Western Blot检测心肌组织或细胞蛋白’fOPK、PTEN、Akt及其磷酸化水平。结果在动物水平,糖尿病可加剧心肌缺血再灌注的损伤,主要表现为降低小鼠再灌注末期平均动脉压、增加心肌梗死面积、提高心肌酶CK-MB和LDH的释放、加剧心肌细胞的凋亡、增加心肌细胞的氧化应激(Diabetic+IR及Diabetic+Sevo-PostC组与IR组比较,P<0.05),同时,糖尿病也消除了七氟烷后处理的心肌保护作用(Diabetic+IR组与Diabetic+Sevo-PostC组比较,P>0.05)。在细胞水平,高糖同样加剧了心肌细胞缺氧再复氧的损伤,显著降低了缺氧再复氧后的细胞活性、增加LDH的释放及心肌细胞的氧化应激(HG+HR及HG+Sevo-PostC组与HR组比较,P<0.05),高糖同样也消除了七氟烷后处理的心肌保护作用(HG+HR组与HG+Sevo-PostC组比较,P>0.05)。但是,心肌细胞内过表达TOPK后可明显增加高糖刺激下缺氧再复氧后的细胞活性并减少LDH的释放(Ad-TOPK+HG+HR及Ad-TOPK+HG+Sevo-PostC组与Ad-vector+HG+HR组比较,P<0.05)。糖尿病或高糖消除了七氟烷后处理诱导的蛋白TOPK、PTEN及Akt磷酸化升高的作用(Diabetic+Sevo-PostC组与Diabetic+IR组比较,P>0.05; HG+Sevo-PostC组与HG+HR组比较,P>0.05),同时也显著减低了蛋白TOPK、PTEN及Akt的磷酸化(Diabetic+IR及Diabetic+Sevo-PostC与IR组比较,P<0.05; HG+HR及HG+Sevo-PostC组与HR组比较,P<0.05)。然而,心肌细胞内过表达TOPK后可以显著增加高糖刺激下PTEN及Akt的磷酸化(Ad-TOPK+HG+HR及Ad-TOPK +HG+Sevo-PostC组与Ad-vector+HG+HR组比较,P<0.05)。结论糖尿病消除了七氟烷后处理的心肌保护作用并增加了心肌细胞的损伤,其机制可能与TOPK/PTEN/Akt信号通路损伤有关。