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千里香为芸香科九里香属植物,具有消炎镇痛、降血糖、抗生育、抗肿瘤等多种药效,目前为中成药三九胃泰的主要原料之一。华润三九医药股份有限公司为生产三九胃泰颗粒每年需要消耗约2000吨的千里香枝条,需要100多万株千里香植株,按单位面积产量来计算大约需要种植3000多亩。据了解,华润三九目前只种植了 800亩千里香。因此,千里香枝条的来源目前主要以野生采摘为主。野生状态下千里香的产量不稳定,且药效不一,所以人工栽培千里香具有必要性和迫切性。目前千里香的繁殖方法主要为种子繁殖,但是野生状态下,千里香较少开花,导致种子数量少,所以千里香依靠种子繁殖的系数小,无法满足大生产的需求。组织培养技术是19世纪初发展起来的植物生物技术,在人工控制的条件下,外植体通过诱导再生成完整的植株。植株再生主要包括两个途径:一是外植体直接诱导器官发生;另一条是外植体通过脱分化形成愈伤组织,愈伤组织再进一步诱导分化形成完整植株。前一个快速繁殖相对简单,繁殖速度较快;后一个技术相对较困难,但是繁殖系数比直接器官发生途径大,另外该体系可以为后续的优良种苗培育等研究奠定基础。目的:本论文通过植株再生的两个途径对千里香进行了组织培养研究,希望建立起千里香优良的快速繁殖体系,为千里香种苗的大量生产、优良品种培育奠定基础。方法:本研究分别以千里香大田苗茎段、种子无菌苗茎段为实验材料,探讨了外植体的消毒方式、茎段的启动培养、继代增殖培养、生根培养等;另外,以大田苗叶片、无菌苗叶片及根段为外植体,通过正交设计得到18个配方进行愈伤组织的诱导,期望筛选出最适宜的外植体及愈伤组织诱导配方。成果:1千里香的快速繁殖研究成果:1.1研究了不同消毒方法对千里香大田苗茎段消毒效果的影响。1.2研究了不同消毒方法对千里香种子消毒效果的影响。1.3研究了不同植物激素及浓度对千里香大田苗腋芽启动的影响。1.4研究了不同植物激素及浓度对千里香腋芽诱导丛生芽的影响。1.5研究了不同植物激素及浓度对种子无菌苗茎段诱导丛生芽的影响。1.6研究了不同植物激素及浓度对千里香试管苗生根的影响。2千里香的愈伤组织诱导及增殖培养研究成果:2.1研究了不同消毒方法对大田苗叶片消毒效果的影响。2.2研究了不同激素及浓度对千里香无菌苗叶片愈伤组织诱导的影响。2.3研究了不同激素及浓度对千里香无菌苗根段愈伤组织诱导的影响。2.4研究了不同诱导配方对愈伤组织增殖培养的影响。结论:1千里香快速繁殖研究结论:1.1千里香的大田苗茎段外植体的最佳消毒方式是:1%次氯酸钠(滴加吐温)消毒15 min再结合0.1%HgCl2浸泡消毒10min,接种后污染率为21.67%,褐化率为10.00%,存活率达 68.33%。1.2千里香成熟种子的最佳消毒方式为:75%乙醇浸泡1 min,然后用0.1%HgC12(滴加吐温)浸泡消毒8min,接种后染菌率为12.3.%,存活率高达93.43%。1.3千里香大田苗茎段启动的最佳培养基配方为两种细胞分裂素结合生长素为最佳启动培养基,其中MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L配方诱导效果最好,诱导率可达95.83%,一个月后腋芽可以长到约平均2 cm的长度。1.4千里香大田苗诱导出的无菌腋芽诱导丛生芽的最佳培养基配方为:MS+6-BA0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L,平均芽的数目为 5.61 个。1.5种子无菌苗茎段诱导丛生芽的最佳培养基配方与大田苗腋芽诱导丛生芽一样,配方为:MS+6-BA0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L,平均芽数达到 9.63个。1.6无菌苗的生根培养最佳培养基配方为:1/2MS+IBA1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L,生根率最高达52.00%,平均根条数4.58条,平均根长2.34 cm。2千里香愈伤组织诱导及继代增殖研究结论:2.1次氯酸钠与HgCl2结合其消毒效果并未如大田苗茎段一样可以降低染菌率,对于大田苗叶片,最佳消毒方法为75%乙醇消毒30 s,然后用0.1%HgCl2消毒12 min(滴加吐温-20),此时的污染率最低为22.22%,褐化率也较低为4.44%,成活率最高达 73.33%。2.2无菌苗叶片在这18个设计配方培养基中均能诱导出愈伤组织,生长素为2,4-D时,愈伤组织出现时间早,但是当2,4-D浓度过高,愈伤组织出现褐化的情况明显;生长素为NAA时,愈伤组织出现时间晚,诱导率相对来说也比较低,但是后期愈伤组织的褐化率较低。实验表明生长素与细胞分裂素的比值以小于2时诱导效果较好,本次试验中,愈伤组织诱导率最高的为2号配方为MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L。2.3无菌苗根段在这18个设计配方培养基中也均能诱导出愈伤组织,愈伤组织诱导率在各配方间有较大差别,最高的为17号配方MS+NAA 3.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L,诱导率达 100%;其次为 14 号配方 MS+NAA 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L,诱导率可达97.22%;而对叶片具有高诱导率的配方2对根的诱导率为63.27%。另外发现2,4-D与NAA对愈伤组织出现的时间没有出现特别大的差异;这18个配方中,愈伤组织的褐化率均较低,10号与17号配方没有出现褐化现象;对于根段诱导愈伤组织,实验表明生长素与细胞分裂素的比值小于等于于1时,愈伤组织诱导率均较低(培养基配方2、3、6、12),这也与叶片所出现的结果不一样。因此,根段愈伤组织诱导的最佳培养基配方为MS+NAA3.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L。2.4两种不同的愈伤组织接种到继代增殖培养基后,愈伤组织生长状况表现不一样。叶片愈伤组织在后面的增殖培养中,来源7、8、9号的愈伤组织出现褐化死亡,其他来源的愈伤组织大都为白绿色、质地坚实,另外发现愈伤组织在诱导配方与增殖配方一致的2号配方中,愈伤组织分化出芽。而对于无菌苗根段愈伤组织的增殖培养结果显示,愈伤组织增殖倍数明显,且愈伤组织为黄白色,质地较好。