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本论文运用现代生物学技术和手段进行了马动脉炎病毒主要结构蛋白基因的克隆、序列分析、原核表达,并在原核表达的基础上初步建立了ELISA 诊断方法;利用新型汉逊酵母表达系统对此病毒的主要结构蛋白基因及其串联表位进行了表达研究;利用真核表达载体构建核酸疫苗并进行了实验免疫研究;同时建立了病毒荧光定量PCR 的诊断技术,全文内容概述如下:1 采用RT-PCR 方法扩增马动脉炎病毒主要免疫原性的结构蛋白GP5、M、N,将它们分别克隆至载体pUC18 和pMD18-T 中,运用DNAstar 等软件对克隆的基因进行了分析,随后将GP5、M、N 三个基因和M 截短基因分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1 和pET32a 中,在E.coli 中进行了诱导表达,结果显示:GP5、M 基因在上述两种原核表达载体中均未检测到表达,M 截短基因(Mt)在pGEX-6P-1 中得到高效表达,而N 基因在两种原核表达载体中均高效表达,表达产物的Western Blot实验证实目的蛋白有生物学活性,有望做为诊断抗原。2 将GP5、M、N 全基因构建到新型汉逊酵母分泌型表达载体pHFMDHZ-α-A中,经电转筛选到含GP5、M、N 全基因的多拷贝重组汉逊酵母,0.5%甲醇诱导,SDS-PAGE 和Western Blot 分析,未检测到目的蛋白的表达。依据GP5、M 和N基因的核苷酸序列翻译的蛋白氨基酸的序列,按汉逊酵母密码子的偏好优化EAVGP5、M 和N 基因密码子,采用人工合成GP5、M 和N 基因的主要抗原表位,通过柔性序列将GP5、M 和N 的表位串联起来,构建了pHFMDHZ-α-GP5-M-N,转化汉逊酵母后成功获得重组菌,诱导表达获得了有生物学活性的目的蛋白,为EAV 新型诊断试剂和亚单位疫苗的生产创造了条件。3 借助真核表达载体pcDNA3 和pVAX1 构建了GP5、M 和N 基因的核酸疫苗,采用脂质体转染BHK-21 细胞的方法,经RT-PCR 检测到相应目的基因的转录,间接免疫荧光试验证明瞬时表达的蛋白能与EAV 抗体发生特异的抗原抗体反应。用单基因和多基因的不同免疫方式,在大鼠中试验了核酸疫苗的免疫效果,pcDNA3