论文部分内容阅读
研究背景:牙周炎(periodontitis,PD)是一种以牙周组织不可逆和进行性降解为特征的慢性疾病,主要引起牙齿缺失和牙槽骨缺损。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)作为牙周修复治疗的种子细胞,在牙周炎不同微环境中修复牙周组织缺损的能力不同。但是,现有的临床治疗,如牙周皮瓣手术,引导组织再生,并加入生长因子,只能清除坏死组织和控制炎症,对牙周组织的修复作用是有限的。幸运的是,近年来,随着组织工程在受损组织再生修复中的广泛应用和研究,干细胞和生物材料在牙周复合组织的生物和功能再生中的研究越来越受到重视。同时,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中存在多种胶原结构,它们可以调节细胞的生理活动,从而影响组织的修复能力。研究目的:本研究旨在探讨特异性ECM中COL4A2对PDLSCs成骨分化以及牙槽骨缺损修复过程影响的机制研究。研究内容:1.经贴壁法获得牙周膜细胞(PDLCs)与骨髓细胞(BMCs),制备牙周膜来源ECM(P-ECM)和颌骨骨髓来源ECM(B-ECM)以及相应的脱细胞ECM(decellularized ECM,dECM)。2.对于牙周膜来源脱细胞ECM(P-dECM)以及颌骨骨髓来源脱细胞ECM(B-dECM)进行电镜和蛋白质质谱(mass spectrometry,MS)分析检测,观察两者差异。3.对特异性ECM进行COL4A2的调控,并研究特异性ECM对于PDLSCs增殖分化的影响。4.Wnt/β-catenin经典通路在特异性ECM对PDLSCs成骨分化作用的机制研究。5.特异性ECM结合PDLSCs和Bio-Oss骨粉分别植入免疫缺陷小鼠皮下以及SD大鼠上颌牙槽骨缺损处,8周后对标本进行Micro-CT扫描以及化学染色,观察移植物的生长情况。研究方法:检测分离的PDLSCs表面标志物及其多向分化能力。本实验制备了牙周膜细胞来源的P-ECM和骨髓细胞来源的B-ECM以及相应的脱细胞ECM。采用透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)、扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)、原子力显微镜(atomic force electron microscopy,AFM)和MS等方法对细胞外基质进行鉴别。通过siRNA转染骨髓细胞,慢病毒转染牙周膜细胞,实现COL4A2在ECM中的调控。在COL4A2调控下,PDLSCs和不同的dECM及Bio-Oss骨粉混合,植入免疫缺陷小鼠皮下或SD大鼠牙槽骨缺损处,并通过组织学或免疫组织化学染色和Micro-CT对修复效果进行检测。研究结果:利用TEM、SEM、AFM等方法,观察P-dECM比B-dECM所含纤维更纤细。蛋白质谱法观察到在B-dECM中,COL4A2含量显著高于P-dECM。同时,PDLSCs在B-dECM中培养时比P-dECM有更强的增殖、维持干性和成骨分化能力。对ECM中的COL4A2进行调控,结果发现上调COL4A2后,P-dECM内生长的PDLSCs增殖能力以及成骨分化能力增强;相反,下调COL4A2后,B-dECM内生长的PDLSCs增殖能力以及成骨分化能力减弱。同时,将特异性ECM结合骨粉以及PDLSCs植入免疫缺陷小鼠以及SD大鼠牙槽骨缺损处,上调COL4A2后,PDLSCs的成骨分化能力增强,修复骨缺损效果提高,而下调COL4A2后,结果则相反。上调COL4A2后,Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达降低,通路被抑制,而成骨相关蛋白表达升高;下调COL4A2后,Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达升高,通路被激活,而成骨相关蛋白表达降低,证实Wnt/β-catenin经典通路在PDLSCs的成骨过程中起着负性调节作用。结论:骨髓来源脱细胞ECM与牙周膜来源脱细胞ECM中差异蛋白COL4A2影响PDLSCs的成骨分化水平。同时,COL4A2通过Wnt/β-catenin经典通路的负性调节作用促进PDLSCs的成骨分化,是一种有前景的修复骨缺损的治疗方法。