目的肺炎链球菌是一种重要的人类条件致病菌,可以导致多种侵袭性疾病。肺炎链球菌在生长过程中会经历一种自发、可逆的表型改变过程,该过程被成为相变。菌落透明度表型改变是相变最典型的性状之一,不同透明型的细菌拥有不同的代谢以及多种特征表型的改变,最终表现为细菌毒力的差异。影响相变发生的因素目前尚未完全明确。有研究认为,肺炎链球菌中,I型限制性甲基化系统SpnD39Ⅲ中编码序列识别亚基的三个hsdS同源基因的重组会导致识别的甲基化位点发生可逆性改变,进而引起细菌全基因组水平的差异甲基化导致相变的发生。SpnD39Ⅲ基因座中的重组酶PsrA被认为介导了hsdS同源基因的位点特异性重组。除此之外,可能还存在其他未知的重组系统参与该基因座的重组。本课题组前期发现了一个Mar R家族转录调控蛋白FabT（SPD＿0379）,其表达缺陷后会引起显著的生长表型改变。进一步研究显示其可能与细菌透明相的改变有关。本研究旨在探究转录调控因子FabT对已知的相变调控因素的调控作用以及可能涉及的未知因素的影响,为揭示肺炎链球菌相变的机制提供新的证据。方法分别使用Janus cassette,frameshift mutant,质粒双交换等方法构建了研究相关菌株。使用透明平板对各研究相关菌株进行了相变观察,评估菌落透明表型的改变。通过FITC-葡聚糖负染法、免疫荧光法、透射电镜、糖醛酸检测等方法对肺炎链球菌的荚膜表达水平进行了评估。利用qRT-PCR排除了lyt A或cps2A对相变的影响。分别通过体内与体外实验,探究FabT缺陷引起的相变对细菌粘附侵袭能力以及对系统性毒力的影响。利用转录组测序分析鉴定了可能受FabT调控并可能与相变相关的因子,筛选出了一个受FabT负调控的重组酶PsrA,其介导I型RM系统SpnD39Ⅲ的位点特异性重组。采用移码突变的方法构建PsrA缺陷菌株,比较FabT和PsrA发生缺陷或回复时的SpnD39III的重组改变,推测FabT和PsrA在介导相变过程中发挥作用的可能机制。结果在链霉素耐药的肺炎链球菌背景下,我们使用无标记的方法构建了fabT与cps突变株。缺陷fabT保留了下游54bp碱基,缺陷cps通过敲除dex B-cps2A基因间区域（cps启动子）,该方法不在基因组上插入额外标记,避免产生极化效应。有荚膜型fabT突变株,在液体培养基中生长显示显著的生长缺陷,有提前死亡的出现。在血平板上显示出更小且粗糙凹陷的菌落。通过透明TSA平板（添加过氧化氢酶）培养,侧向打光显微观察,我们在fabT突变株中观察到透明型菌落比例的显著增加。我们在无荚膜的fabT突变株中观察到了一致的菌落透明型改变。我们通过FITC-葡聚糖负染法、免疫荧光法、透射电镜、糖醛酸检测等方法鉴定了肺炎链球菌荚膜含量的显著减少,无论是表面还是全菌水平。我们推测表面荚膜减少是由于FabT影响膜脂肪酸构成比例影响了荚膜前体在膜上的聚合与成熟,全菌水平的荚膜水平降低可能由于FabT通过未知通路调控了荚膜多糖合成。毒力实验证明,FabT引起的相变显著的降低了肺炎链球菌的系统性毒力水平。体内实验中,fabT突变株在小鼠鼻腔定植能力显著降低,在败血症模型中表现出生存率的增高。细胞黏附实验显示,fabT突变能减少肺炎链球菌对肺细胞上皮A549的黏附与侵袭作用。使用小鼠原代巨噬细胞进行抗吞噬实验显示抗吞噬能力增高,可能是由于其在细胞表面黏附能力降低导致的。提示fabT突变引起的透明型表型改变不仅与荚膜多糖改变相关,也影响了其他细胞表面黏附因子表达。转录组测序对fabT突变株中表达差异的基因进行鉴定,筛选出了67个上调基因,66个下调基因。其中一个I型限制性修饰系统SpnD39Ⅲ的序列识别亚基hsdS的基因转录水平发生显著改变,并伴有其中一个位点特异性重组酶PsrA的转录水平增加。我们通过荧光定量PCR验证了该重组酶的表达增高。重组酶PsrA通常会引起一对或数对反向重复序列IRs的倒位,催化的SpnD39Ⅲ基因座发生位点特异性重组,被认为与相变的发生相关。通过移码突变重组酶PsrA后,fabT缺陷引起的透明型菌落增加表型被完全逆转,提示PsrA的失活可直接引起不透明相的发生。为探究PsrA突变引起的SpnD39Ⅲ重组水平改变,我们使用荧光定量PCR对DNA倒位IRs的影响以及参与位点特异性重组的hsdS亚基进行了重组类型的检测。结果显示,PsrA失活后细菌完全丧失了IR1和IR3介导的倒位,提示PsrA完全催化这两组IRs介导的位点特异性重组过程。fabT突变升高的psrA表达引起了IR3的倒位水平改变。并且在fabT与psrA双突变的情况下,导致了基因组上IR2片段的丢失,提示除了PsrA介导的特异性重组之外,还有其他重组酶介导hsdS基因的切除与重组。hsdS等位基因检测结果显示,在psrA突变情况下,三对IRs介导的六种重组基因型在不同的菌中均被锁定存在,但由于他们在相变观察中均显示一致的不透明型,因此我们推测相变的发生仅与PsrA的活性相关,不与特定的等位基因型相关。此外,FabT与PsrA双突变菌株没有回复荚膜多糖的表达水平,表明FabT调控的荚膜多糖的表达并不是导致透明相变发生的原因。结论转录调控蛋白FabT影响肺炎链球菌生长稳定性,改变细菌菌落相变表型。FabT缺陷可引起细菌荚膜合成减少,并造成细菌系统性毒力的减弱。转录组测序显示FabT突变引起了上百个基因的转录水平改变,提示其在细菌中发挥一个全局性转录调控效应。催化I型RM系统SpnD39Ⅲ发生位点特异性重组的酪氨酸重组酶PsrA在fabT缺陷菌株中表达显著增加,FabT可通过PsrA依赖的方式调控SpnD39Ⅲ基因座的重组,同时引起细菌的相变表型改变。更为重要的是,FabT还存在一种PsrA非依赖的方式调控细菌的相变表型改变。