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接种疫苗是预防传染病的根本途径,疫苗诱导的中和抗体在抗病毒感染中发挥着重要的作用。然而RNA病毒具有高突变频率和进化速率的特点,其包膜糖蛋白序列或抗原性持续发生改变,是此类病毒在疫苗和抗病毒药物开发和使用中面临的主要挑战。我国是狂犬病（rabies）和艾滋病（acquired immune deficiency syndrome,AIDS）的高发国家,引起狂犬病和艾滋病的狂犬病病毒（rabies virus,RABV）和人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）均为RNA病毒,具有较高的突变频率。狂犬病疫苗已广泛使用并具有良好的保护性,而HIV疫苗一直是研究的热点,但仍无问世。对于发病后致死率接近100%的狂犬病,尽管疫苗显示了良好的保护性,但如果RABV糖蛋白（glycoprotein,G）因突变发生抗原性显著变化时,疫苗的保护效果可能会受影响;对于HIV-1,通过突变进化使其包膜蛋白（envelope protein,Env）表面N糖基化修饰发生改变,从而影响中和表位的展示并进而影响Env的抗原性,这也是阻碍HIV-1疫苗研制成功的因素之一。在本研究中我们利用HIV-1假病毒系统,分别对RABV G蛋白单个氨基酸突变以及HIV-1 Env上潜在的N糖基化修饰位点（potential N-linked glycosylation site,PNGS）突变对抗原性的影响进行了研究,以对相应疫苗的使用和研发提供参考。对于RABV G蛋白,我们首先在NCBI Genbank上检索获得了2890条包含完整背景信息的RABV街毒G蛋白全长序列（524个氨基酸）。通过序列分析我们发现,在全球范围内,RABV街毒的G蛋白胞外区序列与人用狂犬病疫苗株的序列相似度呈逐年下降的趋势（p<0.001）,提示RABV街毒G蛋白序列呈多样性,抗原性可能发生了改变。通过进一步对G蛋白胞外区各位点氨基酸的组成和分布进行分析,共选择了103个可能影响G蛋白抗原性的候选突变位点进行评价,候选位点包括:抗原表位内和抗原表位外自然存在的氨基酸变异,以及PNGS位点的删除和引入。通过定点突变,我们以原始病毒株CVS-N2c的G蛋白作为模板,共构建了103个含有单个氨基酸突变的突变株,然后利用HIV-1假病毒系统,进行了RABV假病毒的包装。其中11个突变因显著降低了病毒感染力,无法进行中和试验,我们对剩余的92个突变株进行了G蛋白抗原性的评价,评价用抗体包括6个单抗（monoclonal antibody,mAb）、5种人用疫苗免疫血清和1个人狂犬免疫球蛋白（human rabies immunoglobulin,HRIG）等。通过假病毒中和试验检测,我们发现了显著影响RABV抗原性的位点,这些位点主要分布在抗原表位Ⅲ中,其中R333位点的突变和I338T突变对抗原性影响最为显著,这两个位点的突变使RABV对中和单抗、疫苗免疫血清和狂犬免疫球蛋白的中和敏感性大幅降低,表位Ⅲ中的其他位点突变对抗原性也有一定的影响,如K330和N336等突变。其他抗原表位的突变对病毒抗原性存在不同程度的影响,如表位Ⅰ中的K245M/Q突变使病毒不能被单抗NM57s中和,表位IV和G5中的W251R和R264Q突变对疫苗免疫血清的敏感性降低。抗原表位外的氨基酸突变和PNGS突变对RABV抗原性影响较小。对于突变位点对抗原性的影响机制,我们进一步通过同源结构建模从分子结构水平进行了阐述。在突变株中,W251R、R264Q、K330Q/R/N/E/T、R333L/P/Q/N/H、N336D/G/S/K和I338T突变显著降低了病毒对疫苗免疫血清的中和敏感性,而不同疫苗株免疫的血清对这些抗原变异株的中和能力也存在差异(PM和aGV疫苗株免疫血清的ID50值降低幅度显著高于Flury-LEP疫苗株,p<0.01)。包含这些突变位点的抗原变异株主要分离于2010年左右,呈全球分布,主要分布于北美洲、非洲、亚洲和南美洲,其中美国是北美洲的主要来源国家,中国是亚洲变异株主要来源国家,巴西是南美洲的主要来源国家,在非洲变异株分布较为分散,没有明显的集中分布趋势。部分变异株也呈现特定的地域分布特点,只在特定的区域发现,如R333P只分离于中国,I338T只分离于中国和美国。变异株宿主种类多样,包括狗、猫、蝙蝠、人和多种哺乳动物,但主要分离于浣熊。目前变异株整体上在自然界比例较低（整体比例低于10%）,然而其数量呈逐年递增趋势,应当对这些抗原变异株进行严密的监控。同样作为RNA病毒的HIV-1,其基因组高度变异是阻碍疫苗研制的重要因素之一,而通过突变进化使Env蛋白上的N糖基化修饰发生改变,影响保守中和表位的展示,也是HIV-1疫苗研制中的难点。前期我们在一株CRF07BC亚型病毒FE的Env蛋白上对单个PNGS突变对HIV-1抗原性的影响进行了系统的分析,并发现了影响广谱中和单抗敏感性的位点。目前对于多个PNGS组合突变的影响缺乏系统的研究,本研究中我们结合前期的结果,对PNGS进行了多位点的联合突变删除,并利用HIV-1假病毒系统评价了联合删除对膜蛋白抗原性的影响。通过不同的组合方式,我们共获得了12株PNGS组合删除突变株,其中突变株197M.1（N197D+N301Q）使HIV-1失去了感染力。对剩余的11株突变株进行的中和评价发现,HIV-1 Env蛋白上的PNGS间具有协同效应,相比于原始株FE和单个PNGS删除突变株,联合删除可以显著增强HIV-1对广谱中和单抗和HIV-1阳性血清的敏感性。尤其是N197和N463两个位点的联合删除显著增强了HIV-1对针对CD4结合位点（CD4 binding site,CD4bs）的单抗VRC01和VRC03的敏感性（增强了3001300倍）。通过同源结构建模,我们对N197和N463糖基化位点联合删除的影响机制进行了阐述,这两个PNGS的联合删除可以使VRC01和VRC03的表位充分暴露。CRF07BC亚型病毒株是我国HIV-1主要流行株,以该亚型病毒Env蛋白作为免疫原设计疫苗,符合我国疫苗研制的实际情况,本研究为基于CD4bs表位的HIV疫苗设计中的免疫原的选择和优化提供了参考。