第一部分S1PR3与细菌性脓毒症发生发展的关系研究目的:1-磷酸鞘氨醇受体 3(Sphingosine 1-phosphate receptor 3,S1PR3)是七次跨膜 G蛋白(G protien)偶联受体家族的其中一员,它的主要功能是与磷脂分子1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-phosphate,S1P)相结合,从而启动了细胞跨膜信号转导,调节细胞增殖,血管生成和炎症反应。现在,对于S1PR3调控外周固有免疫细胞及中枢固有免疫细胞的研究较为普遍,主要是集中在促炎反应方面,而在病原微生物清除中的机尚未可知。为此,该部分实验主要集中在检测S1PR3在各类脓毒症模型中的表达及其与脓毒症发生发展的相关性。研究方法:利用骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)建立体外脓毒症模型,定量PCR检测S1PR3表达水平变化。应用盲肠结扎穿孔(cecum ligation and puncture,CLP),制作 WT(S1pr3+/+)、S1pr3+/-及S1pr3-/-三种基因型小鼠脓毒症模型,观察脓毒症小鼠在手术后1Od的生存率;手术后72h应用琼脂平板培养法分别检测血液标本、腹腔灌洗液标本及重要实体器官的细菌负荷量;应用腹腔内针筒定量注射Ecoli,从而制备WT、S1r3+/-及S1pr3-/-三种基因型的脓毒症小鼠腹腔直接感染模型,监测小鼠模型48 h后的生存率;分别于模型后24h,采用琼脂平板培养法检测腹腔灌洗液细菌负荷。研究结果:LPS和热灭活的E.coli刺激后,BMDM的S1PR3表达水平均显著高于生理盐水组(**P<0.01)。CLP模型后,WT小鼠的腹腔巨噬细胞S1PR3表达水平显著高于假手术组(第1天:*P<0.05,第3天:**P<0.01)和静息状态的腹腔巨噬细胞(第1天:**P<0.01,第3天:***P<0.001)。E.coli腹腔感染诱导脓毒症模型后,WT小鼠的腹腔巨噬细胞S1PR3表达水平显著高于假手术组(***P<0.001)和未处理的腹腔巨噬细胞(***P<0.001)。CLP模型后,,S1pr3-/-小鼠的10d生存率(20.0%)显著低于 WT 小鼠(76.2%)和S1pr3+/小鼠(79.2%)(****P<0.001),S1pr3-/-脓毒症小鼠血液标本、腹腔灌洗液标本、肺脏组织、脾脏组织及肝脏组织细菌负荷量较WT脓毒症小鼠明显升高。E.coli腹腔感染诱导脓毒症模型后,S1pr3-/-小鼠的48h生存率(15.4%)显著低于WT小鼠(47.8%)和S1pr3+/-小鼠(52.9%)(*P<0.05),S1pr3-/-小鼠腹腔灌洗液细菌负荷较WT小鼠显著升高(**P<0.01)。MRSA腹腔感染诱导脓毒症模型后,S1pr3-/-小鼠的48h生存率(15.4%)显著低于 WT 小鼠(47.8%)和S1pr3+/-小鼠(52.9%)(*P<0.05),S1pr3-/-小鼠腹腔灌洗液细菌负荷较WT小鼠显著升高(*P<0.05)。研究结论:S1PR3在脓毒症发生发展中具有重要作用;S1PR3缺失导致病原体清除能力和脓毒症模型小鼠生存率下降;S1PR3对宿主具有保护作用。第二部分S1PR3对巨噬细胞杀菌活性的影响研究目的:考虑到S1PR3缺失的脓毒症小鼠与WT脓毒症小鼠相比,细菌负荷量升高,免疫力及低抗力下降,脓毒症小鼠的死亡率上升。因此,有必要明确哪一类免疫细胞的S1PR3缺失有着这样的作用。研究方法:首先,制作四种成熟的骨髓移植嵌合体模型:S1pr3-/-→S1pr3-/-,WT→WT,S1pr3-/-→WT,和WT→S1pr3-/-,建成模型后腹腔定量注射E.coli,观察感染后四种嵌合体模型小鼠48 h生存率,并在感染24 h后,琼脂平板培养法检测腹腔灌洗液细菌负荷。构建表达S1PR3的重组腺病毒和对照腺病毒,分别感染BMDM。高表达S1PR3的BMDM于脓毒症模型诱导后立即回输至小鼠体内,观察重组S1PR3对脓毒症小鼠48h生存率的影响,另外在感染24 h后,琼脂平板培养法检测腹腔灌洗液细菌负荷。S1PR3激动剂于CLP模型后0.5h注射至小鼠体内,观察实验组和对照组48h生存率。S1PR3激动剂于腹腔感染E.coli诱导脓毒症模型后0.5h、3h及6h注射至小鼠体内,观察实验组和对照组48h生存率,并在Ecoli感染3h和6h后,琼脂平板培养法检测腹腔灌洗液、肺脏、脾脏和肝脏细菌负荷。研究结果:E.coli腹腔感染模型后,WT→S1pr3-/-组48h生存率(33.3%)显著高于S1pr3-/-→S1pr3--组(0.0%,*P<0.05),WT→S1pr3-/-组24h腹腔灌洗液的细菌负荷显著低于S1pr3-A →S1pr3-/-组(*P<0.05);S1pr3-/→WT 组 48h 生存率(20.0%)显著低于WT→WT组(50.0%,:*P<0.05),S1pr3-/→WT组24h腹腔灌洗液的细菌负荷显著高于WT→WT组(*P<0.05)。腺病毒高表达巨噬细胞S1PR3后建立脓毒症模型,回输高表达S1PR3的BMDM的小鼠48h生存率(85.71%)显著高于对照组(50.0%,*P<0.05),回输高表达S1PR3的BMDM的小鼠的细菌清除能力也显著高于对照组(*P<0.05)。S1PR3激动剂于CLP模型后0.5h注射至小鼠体内,实验组48h生存率显著高于对照组(*P<0.05)。S1PR3激动剂于腹腔感染E.coli诱导脓毒症模型后0.5h、3h及6h注射至小鼠体内,实验组48h生存率均显著高于对照组(*P<0.05,**P<0.01),WT小鼠腹腔灌洗液、血液、肺、脾和肝的细菌负荷均显著低于对照组(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。体外吞噬实验,S1pr3-/-小鼠BMDM与WT小鼠BMDM的吞噬能力在15min、30min、60min和120min时均无显著差异,S1pr3-/-小鼠腹腔巨噬细胞与WT小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力在15min、30min、60min和120min时无显著差异;体外杀菌实验(庆大霉素保护实验),S1pr3-/-小鼠BMDM的存活细菌数在3h和6h均显著高于WT小鼠BMDM(*P<0.05),S1pr3-/-小鼠腹腔巨噬细胞的存活细菌数在3h和6h均显著高于WT小鼠腹腔巨噬细胞(*P<0.05,**P<0.01),S1PR3激动剂处理后WT小鼠腹腔巨噬细胞的存活细菌数在3h和6h显著低于对照组(*P<0.05,a:**P<0.01)。研究结论:S1PR3通过巨噬细胞的杀菌能力,而非吞噬能力来发挥抗菌能力;提高内源性S1PR3活性有利于提高巨噬细胞细菌清除能力,在小鼠感染中发挥保护作用。第三部分S1PR3促进巨噬细胞杀菌功能的分子机制研究目的:基于以上二部分的研究,S1PR3缺失可使巨噬细胞降低杀菌能力,加重小鼠全身细菌负荷,降低生存率。本部分将深入探讨S1PR3信号通路增强巨噬细胞杀菌能力的可能分子机制。研究方法:体外分离WT及S1pr3-/-小鼠腹腔巨噬细胞,热灭活的E.coli刺激后,分别静置 Omin、15min、30min、45min、60min 及 90 min,用化学发光法检测 NOX2 活性,荧光酶标仪检测ROS水平和吞噬体pH值。体外分离WT及S1pr3-/-小鼠腹腔巨噬细胞,大肠杆菌膜提取物包被过的3μm beads(beads:cell=10:1)刺激后,免疫荧光和Western blot检测吞噬体不同成熟阶段标志物和Vps34水平。免疫共沉淀检测S1pr3--和WT小鼠中Vps34与Gi,Gq和G12偶联的水平。S1PR3激动剂于腹腔感染Ecoli诱导脓毒症模型后0.5 h注射至小鼠体内,观察S1pr3-/-和WT小鼠的48h生存率,并在E.coli感染6h后,琼脂平板培养法检测腹腔灌洗液和血液的细菌负荷。研究结果:热灭活的E.coli 刺激后 15min、30min、45min、60min 和 90min,WT 小鼠腹腔巨噬细胞ROS水平显著高于S1pr3-/-小鼠腹腔巨噬细胞(***P<0.001,***p<0.001,***p<0.001,**p<0.01,***p<0.001)。热灭活的E.coli刺激后 15min、30min、45min、60min和90min,WT小鼠腹腔巨噬细胞NOX2水平显著高于S1pr3-/-小鼠腹腔巨噬细胞(**P<0.01,***P<0.001)。热灭活的Ecoli刺激后15min、30min、45min、60min和90min,WT小鼠腹腔巨噬细胞吞噬溶酶体pH值高于S1pr3-/-小鼠腹腔巨噬细胞,但无统计学差异。E.coli外膜提取液覆盖的聚苯乙烯球刺激后,WT小鼠腹腔巨噬细胞在90min时LAMP-1水平显著高于S1pr3-/-小鼠腹腔巨噬细胞(*P<0.05),WT小鼠腹腔巨噬细胞EEA1水平显著高于S1pr3--小鼠腹腔巨噬细胞(**P<0.01),WT小鼠腹腔巨噬细胞Vps34水平显著高于S1pr3-/-小鼠腹腔巨噬细胞(*P<0.05),WT小鼠腹腔巨噬细胞在30min和60min时PtdIns(3)P水平显著高于S1pr3-/-小鼠腹腔巨噬细胞(*P<0.05)。免疫共沉淀检测发现,E.coli产物覆盖的聚苯乙烯球刺激后,WT小鼠腹腔巨噬细胞Vps与Gi,Gq和G12耦联水平显著高于S1pr3-/-小鼠。腹腔感染模型后,S1PR3激动剂处理后巨噬细胞特异性Vps34-/-小鼠生存率显著低于S1PR3激动剂处理后同窝对照WT小鼠(*P<0.05),S1PR3激动剂处理后巨噬细胞特异性Vps34-/-小鼠生存率与安慰剂处理后同窝对照WT小鼠生存率无明显差异,S1PR3激动剂处理后巨噬细胞特异性Vps34-/-小鼠腹腔灌洗液和血液细菌负荷与安慰剂处理后同窝对照WT小鼠无明显差异。研究结论:S1PR3通过促进Vps34在吞噬体富集,一方面上调吞噬体NOX2活性,促进氧依赖途径细菌清除;另一方面,加快吞噬体成熟进程,促进非氧依赖细菌清除,从而参与维持脓毒症免疫功能稳态。第四部分单核巨噬细胞S1PR3的表达与脓毒症预后的关系研究目的:基于前面三部分的研究,可以明确S1PR3通过促进细菌清除,表明了 S1PR3具有保护脓毒症小鼠的作用。为进一步研究临床应用价值,我们以S1PR3为靶点进行处理,采集对照组患者和ICU脓毒症患者的外周血,检测其中的单核巨噬细胞,研究S1PR3的表达水平与脓毒症预后的关系,同时检测了单核巨噬细胞的杀菌功能。研究方法:根据脓毒症最新的诊断标准,在浙江大学医学院附属医院重症监护室(ICU),共纳入从2016年9月至2016年12月之间收治的健康对照者31例、非脓毒症患者26例、脓毒症患者共44例,排除化疗、AIDS、激素治疗和器官移植等患者。在患者收治ICU的第一个24 h,收集患者基本信息、SOFA(Sequential Organ Failure Assessment)评分、APACHE II(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II)评分等相关资料,用以判断脓毒症预后。同时抽取患者的外周血至少6 ml。外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)采用 Ficoll 法进行分离,定量 PCR 检测 S1PR3 mRNA 和人白细胞抗原-DR(human leukocyte antigen-DR,HLA-DR)水平。不同患者的PBMC有着不同的S1PR3mRNA表达水平,然后以荧光显微镜观察其对Ecoli的杀菌能力。研究结果:定量PCR检测获得的数据表明,ICU非脓毒症患者对照组和脓毒症患者的S1PR3表达水平,与健康对照组相比,均明显升高(*P<0.05,***P<0.001),ICU非脓毒症患者对照组的S1PR3表达水平较脓毒症患者显著升高(***P<0.001),脓毒症存活患者的S1PR3表达水平均较脓毒症死亡患者显著升高(**P<0.01)。脓毒症患者S1PR3水平与SOFA评分呈负相关(r =-0.38,P<0.01)。定量PCR检测数据显示,HLA-DR>30%组S1PR3水平较HLA-DR<30%组显著升高(**P<0.01),脓毒症患者S1PR3水平与PBMC杀菌能力呈正相关(r=0.56,P<0.05)研究结论:脓毒症不良预后与外周血单核细胞S1PR3表达水平下降有着相关性,可以通过干预S1PR3来进行脓毒症的治疗。