研究背景和目的：肺癌是世界上最常见和严重危害人体健康和生命的恶性肿瘤之一,尽管现代医学飞速发展,其发病率和死亡率仍居高不下。世界卫生组织(WHO)根据其生物学特征和临床治疗规范分成两大类,非小细胞肺癌和小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌占肺癌总数的85%以上。对于大多数的恶性肿瘤,如果早期发现,其预后往往良好,但如果晚期发现,则预后较差。同样,尽管肺癌的个体化综合治疗取得可喜的进步,转移性肺癌病人的预后仍不乐观,5年生存率小于15%。一方面是由于缺乏有效而经济的早期诊断手段,另一方面是肺癌的分子发生机制仍需进一步阐明。因此,在分子层面加强对非小细胞肺癌的认识,并能应用在临床诊断、治疗和预测预后上,吸引了众多科研工作者的关注。在过去的25年里,学者发现了一些在肺癌发生发展中起重要作用的分子遗传学变化,包括BRAF, KRAS, EGFR, FHIT, HER2/NEU, RB, p16INK4A和p53等的突变。另外,有些基因虽然没有突变,但在非小细胞肺癌中无法表达,例如,p16INK4A和CDH1在表观遗传学上的基因沉默也在肺癌的发生发展中扮演重要的角色。一项发现4个基因的甲基化与非小细胞肺癌预后相关的临床研究更加强调了表观遗传学机制在非小细胞肺癌的发生发展中起重要作用。SWI/SNF复合体是存在于真核生物和原核生物的一种进化保守的染色质重塑复合物,有大约10到12个亚单位构成,最先发现于Saccharomyces cerevisiae。SWI/SNF复合体能利用催化亚基BRG1或者BRM水解ATP产生能力动员核小体,重构染色体,从而调节靶基因的转录。SWI/SNF复合体亚单位包括BRG1/SMARCA4, ARID1A, PBM1和SNF5/INI1等,他们往往是抑癌基因或者与抑癌基因协同作用。SWI/SNF复合体广泛参与各种生物过程,包括基因转录,细胞周期调控和细胞分化等。SWI/SNF染色质重塑复合物在肿瘤发生发展过程中的机制仍然未知,其研究已经成为一个热点领域。其缺失致肿瘤作用的机制可能与DNA修复过程,调控细胞周期,转录调控以及核小体的占位相关。最近的二代测序技术发现肿瘤组织中广泛存在SWI/SNF复合体成员的突变,包括BRG1/SMARCA4, ARID1A, PBM1和SNF5/INI1等。在肺癌组织中,BRG1和ARID 1A的突变率根据研究的不同介于10-20%之间。因此,这强调了SWI/SNF复合体在肺癌发生发展中的作用亟需阐明。NRF2 (NF-E2-related factor)属于Cap’N’Collar (CNC)家族成员,包含一个进化上保守的basic leucine zipper (bZIP)区域。NRF2广泛存在于全身大部分器官,其主要功能是作为转录因子,能激活大约200个基因对抗氧化应激对机体的损害。NRF2主要受KEAP1调控。在生理条件下,NRF2主要存在与细胞质中,KEAP1的Kelch结构域与其ETGE和DLG motif结合,相比DLGmotif, KEAP1与ETGE motif的亲和力更强,根据以上观察,McMahon和Tong等提出了hinge-and-latch模型,即KEAP1首先与NRF2的ETGE motif结合(hinge),一旦相互作用建立,DLG motif (latch)进入一个临近未被结合的KEAP1的Kelch结构域,从而促进NRF2被降解。因此,KEAP1-CUL3-E3泛素连接酶复合体精确调控NRF2在细胞内的水平,并保持其在生理条件下低水平表达。在氧化应激的条件下,KEAP1的几个半胱氨酸残基可被共价修饰,KEAP1构象发生改变,导致NRF2从低亲和力的DLG motif上脱落,从而使NRF2的降解受到抑制。因此,KEAP1的NRF2结合区域被NRF2所饱和,新合成的NRF2进入细胞核,与Maf蛋白家族成员结合长异二聚体,与抗氧化反应元件结合,促进其下游基因的表达。通过激活这些基因,NRF2能启动细胞内的保护机制,因而能提高细胞的生存能力。NRF2可以做为抑癌基因,防止肿瘤的发生。然而,最近的研究表明,NRF2不但能保护正常细胞,也能保护肿瘤细胞。本课题组前期研究发现,在BRG1和BRM均失活的细胞系中再表达BRG1能诱导表观遗传学上沉默的基因表达。我们观测到BRG1再表达和5-dAzaC(DNA甲基转移酶抑制剂)处理后诱导的基因表达有重复。当时,我们未检测组蛋白乙酰化对基因表达的影响。由于我们只检测了有限数目的基因,因此无法确定BRG1再表达后与DNA甲基转移酶抑制剂或者HDAC抑制剂处理后到底有多少重叠基因。为此,我们利用基因芯片技术(microarray)检测在BRG1再表达后以及DNA甲基转移酶抑制剂和HDAC抑制剂处理后基因表达的变化。应用腺病毒感染细胞的其中一个缺点是BRG1蛋白的过量表达。为了解决这个问题,我们通过转染H522和A427细胞BRG1表达质粒来避免BRG1的过表达,从而验证microarray的结果。再利用RLGS技术和公开发表的甲基化芯片数据了解BRG1缺失与DNA甲基化的关系。为了进一步探讨BRG1失活在非小细胞肺癌的发生发展中的机制,我们应用shRNA (short hairpin RNA)干扰技术建立稳定的低表达BRG1的肺腺癌细胞系H358。为了控制干扰的特异性,我们应用两个不同序列的shRNA干扰BRG1的表达。同时,我们应用CRISPR技术建立稳定敲除BRG1的H358单细胞克隆细胞株。BRG1在H358细胞中表达降低后,细胞形态发生变化,从立方形聚集状态,变成拉长分散的状态。我们将这些低表达BRG1的H358细胞和正常表达BRG1的H358接种到裸鼠的肺组织,发现BRG1低表达组的小鼠平均生存期大大缩短,并往往长出较大的肿瘤,提示BRG1低表达后,肿瘤的成瘤能力增强。由于最近的二代测序技术发现肺肿瘤组织中有大量的KEAP1和NRF2基因突变。那么,BRG1/BRM失活与KEAP1-NRF2-ARE信号通路关系如何,BRG1/BRM失活是否能够激活KEAP1-NRF2-ARE通路来促使肿瘤进展?方法：1.以细胞株H522和SW13为研究对象,分别以5-dAzaC±TSA处理或者BRG1/BRM质粒转染细胞48小时后,收集细胞提取总RNA和总蛋白,western blot检测BRG1, BRM, CDH1和CK-18的表达,判断在BRG1/BRM失活的细胞系中再表达BRG1和BRM是否可使表观遗传学上沉默的基因再表达。2.分别应用载有BRG1-GFP和GFP的腺病毒感染H522细胞,DMSO,5 μmol/L 5-dAzaC和100 nmol/LTSA处理H522细胞,48小时后收集细胞提取总RNA后,进行基因芯片分析,阐明BRG1再表达,DNA甲基化,组蛋白乙酰化之间的关系。3.应用腺病毒感染细胞的其中一共缺点是BRG1蛋白的过量表达。为了解决这个问题,我们通过转染H522细胞BRG1表达质粒来避免BRG1的过表达。在此,增加了另一个BRG1/BRM表达缺失的非小细胞肺癌细胞系A427。应用BRG1表达质粒转染A427和H522细胞系48小时后,收集细胞提取总蛋白和RNA, western blot和QPCR分别检测CDH1, CD44以及新的BRG1调控基因(CDH3,EHF, RRAD)的表达。4.应用BRG1表达质粒转染A427和H522细胞系48小时后,提取DNA,进行RLGS检测在H522和A427中再表达BRG1后DNA甲基化的变化。通过探求BRG1再表达是否会在非小细胞肺癌中改变DNA甲基化判断BRG1缺失与DNA甲基化的关系。5.应用一项公开发表的利用DNA甲基化芯片来比较69个非小细胞肺癌细胞系(包括A427和H522)甲基化规律的数据,判断基因DNA甲基化的水平能否预测BRG1再表达对其的效应。例如,高水平的DNA甲基化是否会抑制BRG1再表达引起的下游基因表达变化的效应。6.应用shRNA干扰技术在BRG1/BRM野生型肺腺癌细胞系型H358建立BRG1和/或BRM表达减少的细胞模型。7.对BRG1和/或BRM表达减少的肺腺癌细胞系H358,提取总蛋白和总mRNA, western blot和QPCR检测KEAP1-NRF2-ARE信号通路下游基因mRNA和蛋白的表达。8.应用CRISPR技术建立了BRG1敲除的肺腺癌细胞系H358, western blot检测BRG1, BRM, KEAP1, NRF2, HMOX1和NQO1的蛋白表达。9.根据NRF2与HMOX1启动子结合DNA序列设计了引物,应用染色质免疫共沉淀(ChIP)的方法,评估NRF2与HM0X1启动子结合能力。分别用75μM tBHQ和等量的乙醇处理细胞,6小时后收获细胞进行ChIP实验,超声破碎基因组DNA后,分别用NRF2,RNAP Ⅱ,BRG1和IgG抗体分别进行免疫沉淀,沉淀复合物经过洗涤后提取DNA,用QPCR技术检测其与HMOX1的启动子DNA的结合能力。10.为了评估ROS的产生过多是否是引起KEAP1-NRF2-ARE信号通路激活的一种机制,应用NAC处理BRG1表达减少的肺腺癌细胞系H358细胞48小时后,分别进行western blot和ChIP实验,western blot检测KEAP1, NRF2, HMOX1和NQO1的蛋白表达。ChIP实验检测NRF2与HMOX1启动子结合能力。分别用NRF2,RNAP Ⅱ,BRG1和IgG抗体分别进行免疫沉淀,沉淀复合物经过洗涤后提取DNA,用QPCR技术检测其与HMOX1的启动子DNA的结合能力。11.应用一项公开发表的TCGA肺腺癌肿瘤组织DNA测序和RNA测序的数据,利用15个NRF2的下游基因组成的gene signature代表KEAP1-NRF2-ARE信号通路的活性,分析了BRG1低表达肺癌患者组织标本KEAP1-NRF2-ARE信号通路活性是否增加。选用具有BRG1无义或者框移突变定义BRG1低表达的临界值。12.统计学分析数据分析采用SPSS13.0软件分析,计量资料结果以均数±标准差(x±s)表示。比较组间差异两组采用独立样本t检验；多组间均数比较用单向方差分析(one way ANOVA),多重比较时,方差齐性用LSD法,方差不齐用Dunnett法。P<0.05认为有统计学意义。RNA-seq数据分析采用R 2.15.1软件分析并作图,不遵从正态分布,组间KEAP1/NRF2 gene signature表达差异用Kruskal-wallis H检验,P<0.05认为有统计学意义,两两比较用双侧Wilcoxon rank sum test,多重比较检验水准α=0.05/C42=0.008,P值小于α认为有统计学意义。结果：1.在BRG1/BRM失活的细胞系中再表达BRG1和BRM可使表观遗传学上沉默的基因再表达在BRG1/BRM缺失的SW13和H522中不管是应用TSA还是5-dAzaC处理,还是再表达BRG1或者BRM均会诱导CDH1蛋白的表达。然而,应用ATPase酶失活型的BRG1 (DNBRG1)或者DMSO对CDH1的表达无影响。2.在非小细胞肺癌细胞系H522再表达BRG1对基因表达影响的分析对H522的microarray实验进行分层群聚分析,然后制作热点图来寻找基因表达的共同特征。结果显示,各个处理组中的四个重复群聚在一起,表示他们之间的基因表达模式一致。感染腺病毒两组之间相似度大于他们与TSA组或者5-dAzaC组之间的相似度,提示感染载有GFP的腺病毒本身会引起基因表达的变化。DMSO组与其他各组之间的相似性最小,而TSA组和5-dAzaC组之间的相似度最大。对H522的microarray实验分析了Ad-BRG1-GFP腺病毒感染后的表达发生变化的基因,结果显示5527个基因表达升高,6510个基因表达下降。然而,这是高估了其所引起的基因表达的数目,因为在所有的条件下有些基因的表达下降了。5-dAzaC处理后,2436个基因表达升高,2763个基因表达下降。相比较而言,TSA处理后更少的基因表达发生变化,即560个基因表达升高,995个基因表达下降。对H522的microarray实验两种方法处理后表达升高的基因,429个基因在5-dAzaC处理后或者BRG1再表达后升高。然而,为了保守起见,我们只关注升高两倍以上的基因。在这429个基因中,BRG1再表达后升高两倍以上有145个基因。同样,186个基因在TSA处理或者BRG1再表达后升高,其中,140个基因在BRG1再表达后升高两倍以上。有170个基因在5-dAzaC或者TSA处理后表达升高,其中148个在TSA处理后至少升高2倍。我们分析了在三种条件下均升高的基因。本组基因数目最少,有85个基因,其中有55个基因在BRG1再表达后升高两倍以上。3.验证microarray数据应用两独立样本t检验分析,BRG1再表达组(H522 BRG1)与阴性对照组(H522 pCDNA3)比较各基因(BRG1, CDH1, CDH3, EHF和RRAD) mRNA表达显著升高,差异有统计学意义(t值和P值分别为t=-4.992, P=0.015;t=-7.181, P=0.005;t=-9.311,P=0.003; t=-7.686, P<0.001;t=-12.737, P<0.001)。 BRG1再表达组(A427 BRG1)与阴性对照组(A427 pCDNA3)比较各基因(BRG1, CD44, EHF和RRAD) mRNA表达显著升高,差异有统计学意义(t值和P值分别为：t=-12.005, P=0.001; t=-5376, P=0.005; t=-2.521, P=0.045; t=-4.958, P=0.015)。Western blot检测结果与QPCR基本一致。4. BRG1再表达后基因表达的变化与DNA甲基化水平不相关对H522进行RLGS分析后发现BRG1再表达产生3个明显的酶切谱。然而,对此部分DNA测序后发现,他们来源于转染的BRG1基因而非由于H522细胞DNA的甲基化变化。同样的结果见于A427。应用一项发表的利用DNA甲基化芯片来比较69个非小细胞肺癌细胞系的甲基化规律的数据分析,结果显示427细胞的CD44整个基因长度的甲基化水平明显高于H522的。然而,BRG1再表达诱导CD44表达只见于A427细胞。H522的CDH3启动子区域显著低于A427的甲基化水平,这与BRG1再表达只在H522细胞中诱导其表达这一现象相符。A427的RRAD的基线表达水平高于H522的,尽管A427不管是在启动子还是在编码区DNA甲基化水平都显著高于H522。同样,我们未观测到CDH1甲基化水平与表达的关联。5.BRG1和BRM shRNA显著抑制BRG1和BRM mRNA和蛋白的表达分别应用单向方差分析,BRG1和/或BRM干扰组与阴性对照组比较(control组)BRG1和BRM的mRNA表达有显著差异(F=134.901,P<0.001；F=154.963,P<0.001),分别进行两两比较后发现,相对于control组,BRG1干扰组和BRG1/BRM双干扰组BRG1 mRNA表达水平显著降低,P值均小于0.05,差异有统计学意义；BRM干扰组和BRG1/BRM双干扰组BRMmRNA表达水平显著降低,有统计学意义,P值均小于0.05。Western blot的检测结果与QPCR基本一致。6.BRG1和BRM基因抑制后显著影响KEAP1-NRF2-ARE信号通路的下游基因表达BRG1干扰组和BRG1/BRM双干扰组与阴性对照组(control组)相比较,NRF2和KEAP1二聚体的蛋白表达水平显著增加,然而NRF2 mRNA水平在各组间的表达无显著变化(F=0.971,P=0.462),提示KEAP1蛋白的失活。在Western blot上所检测的KEAP1二聚体是SDS阻抗的,代表失活的KEAP1蛋白,其增加代表KEAP1-NRF2-ARE信号通路的激活。BRM干扰组NRF2和KEAP1二聚体的表达水平无显著变化。分别应用单向方差分析,BRG1和/或BRM干扰组与阴性对照组比较(control组)NRF2下游基因HMOX1, GSTM4, GCLM和NQO1的mRNA的表达有显著性差异,(F值和P值分别为:F=36.083,P<0.001; F=50.924,P<0.001; F=30.126,P<0.001; F=57.529,P<0.001)。分别进行两两比较后发现,BRG1干扰组和BRG1/BRM双干扰组与control组比较,HMOX1和GSTM4的mRNA的表达升高,P值均小于0.05,差异有统计学意义；BRM干扰组与control组比较HMOX1和GSTM4的mRNA表达无差异,P值分别为0.154和0.259,差异无统计学意义。BRM干扰组GCLM和NQO1的mRNA表达较control组升高,P值均小于0.05。BRG1干扰组(Brgli.2)和BRG1/BRM双干扰组(Brgli.2brm)与control组比较,GCLM的mRNA表达降低,P值小于0.05。Western blot的检测结果与QPCR基本一致。和以上shRNA干扰实验基本一致的是,应用CRISPR敲除BRG1后,NRF2, KEAP1二聚体和HMOX1的表达上调,而NQO1的表达无明显变化。7.BRG1调控转录因子NRF2与其下游基因启动子DNA结合能力tBHQ处理后,NRF2在HMOX1启动子区域的结合显著增加,而转录起始点和转录起始点下游500bp的区域无结合。无论在tBHQ还是等量乙醇处理的细胞,与H358组和control组相比,BRG1干扰组和BRG1/BRM双干扰组NRF2在HMOX1启动子区域(EN2和EN1)的结合能力显著增强。未经tBHQ处理时,与H358组和control组相比,BRG1干扰组和BRG1/BRM双干扰组RNA polymerase Ⅱ在HMOX1结合区域(EN2, TSS,和+500bp)的结合能力显著增强,有统计学意义(F值和P值分别为F=27.947, P<0.001; F=19.001, P<0.001; F=16.996, P<0.001);经过tBHQ处理后,与H358组和control组相比,BRG1干扰组和BRG1/BRM双干扰组RNA polymerase Ⅱ在HMOX1结合区域(EN2, TSS,和+500bp)的结合能力也显著增强,有统计学意义(F值和P值分别为F=30.788, P<0.001;F=52.721, P<0.001;F=22.443, P<0.001).未经tBHQ处理时,与H358组和control组相比,BRG1干扰组和BRG1/BRM双干扰组BRG1在HMOX1结合区域(EN2,EN1,TSS和+500bp)的结合能力明显减弱,有统计学意义(F值和P值分别为F=8.875, P=0.002; F=19.817, P<0.001; F=7.123, P=0.005; F=4.195, P=0.030);经过tBHQ处理后,与H358组和control组相比,BRG1干扰组和BRG1/BRM双干扰组BRG1在HMOX1结合区域(EN2,EN1,TSS和+500bp)的结合能力也明显减弱,有统计学意义(F值和P值分别为F=40.734, P<0.001;F=25.318, P<0.001; F=11.231, P=0.001; F=6.057, P=0.009)。8. BRG1表达减少使细胞内ROS的产生增加应用NAC处理相应的细胞后进行western blot和ChIP实验,western blot结果显示,NAC处理后,对照组的KEAP1二聚物和HMOX1的水平无显著变化,而BRG1干扰组的KEAP1二聚物和HMOX1的水平显著下降；ChIP实验结果显示,未经NAC处理,BRG1干扰组NRF2在HMOX1启动子区域的结合水平较control组明显增加,差异有统计学意义(t值和P值分别为：t=-6.061,P=0.001; t=-3.128, P=0.020)。NAC处理后,BRG1干扰组NRF2在HMOX1启动子区域的结合水平较control组变为无显著变化,差异无统计学意义(t值和P值分别为：t=-0.059, P=0.955; t=-0.638, P=0.558).同样,未经NAC处理,BRG1干扰组RNA polymerase Ⅱ在HMOX1结合区域(EN2,TSS,+500bp)的结合水平明显增加,差异有统计学意义(t值和P值分别为：t=-7.048,P=0.004;t=-3.139, P=0.020;t-4.736, P=0.003)。NAC处理后,BRG1干扰组RNA polymerase Ⅱ在HMOX1启动子区域的结合水平较control组变为无显著变化,差异无统计学意义(t值和P值分别为:t=-0.627, P=0.553;t=0.301, P=0.774;t=1.581, P=0.165).未经NAC处理时,与control组相比,BRG1干扰组在HMOX1结合区域(EN2,EN1,TSS和+500bp)的结合能力明显减弱,有统计学意义(t值和P值分别为:t=5.193, P=0.002;t=7.668, P<0.001;t=5.436, P=0.002;t=4.101, P=0.006);经过NAC处理后,与control组相比,BRG1干扰组BRG1在HMOX1结合区域(EN2,EN1,TSS和+500bp)的结合能力也明显减弱,有统计学意义(t值和P值分别为:t=5.371, P=0.002;t=5.348, P=0.002;t=3.832, P=0.009; t=6.299, P=0.001).9.BRG1低表达肺癌患者组织标本KEAP1-NRF2-ARE信号通路活性增加相对于野生型组的标本(group 1),具有KEAP1/NRF2突变的肺癌标本(group 2) (group 1 vs group 2)和BRG1低表达组(group 3) (group 1 vs group 3) KEAP1-NRF2-ARE信号通路活性分别显著增高；相对于具有KEAP1/NRF2突变的肺癌标本(group 2), BRG1低表达并且具有KEAP1/NRF2突变的肺癌标本(group 4) (group 2 vs group 4) KEAP1-NRF2-ARE信号通路活性显著增高,差异均具有统计学意义。应用kruskal-wallis H检验,各组间的KEAP1-NRF2-ARE信号通路的活性有差异,H=95.881,P<0.001,差异有统计学意义。应用Wilcoxon rank sum test两两比较,相对于野生型组的标本(group 1), KEAP1/NRF2突变组(group 1 vs group 2)和BRG1低表达组(group 3) (group 1 vs group 3) KEAP1-NRF2-ARE信号通路活性分别显著增高,差异有统计学意义(P值均小于校正后的α值)；相对于具有KEAP1/NRF2突变的肺癌标本(group 2), BRG1低表达并且具有KEAP1/NRF2突变的肺癌标本(group 4) (group 2 vs group 4) KEAP1-NRF2-ARE信号通路活性有增高的趋势,但由于group 4样本量过少(n=4),差异无统计学意义(双侧wilcoxon rank sum test,P值为0.013,大于校正后的α值,单侧wilcoxon rank sum test的P值为0.006,小于校正后的a值)。结论：1.BRG1失活在肺癌发生发展过程中引起的基因沉默与DNA甲基化无关,为一种独立的基因沉默的机制。2.在BRG1/BRM失活的非小细胞肺癌细胞系中再表达BRG1可使表观遗传学上沉默的基因(例如CDH1,CDH3,CD44,EHF和RRAD)再表达。3.在非小细胞肺癌细胞系中BRG1低表达激活KEAP1-NRF2-ARE信号通路。4.在非小细胞肺癌肿瘤组织中,BRG1低表达激活KEAP1-NRF2-ARE信号通路,因此设计NRF2或者NRF2下游基因的抑制剂可能会使BRG1表达缺失的病人获益。