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血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）是动脉壁的主要细胞成分,通过维持血管壁的张力和完整性在血管稳态中发挥重要作用。在病理条件下,VSMC可以去分化为合成表型,获得增殖、迁移和合成细胞外基质的能力,这个过程被称为表型转化,是动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等血管重塑性疾病的病理学基础。干扰素刺激基因15（Interferon-stimulated gene 15,ISG15）是一种分子量为15k Da的类泛素蛋白。其在序列、结构和功能上与泛素类似,可通过酶促级联反应共价修饰靶蛋白使之发生ISG15化修饰,但并不直接介导蛋白质的降解,而是参与细胞信号转导、基因表达调控等过程。近年来许多研究表明ISG15可针对多种病毒发挥抗病毒活性,并在微生物感染的宿主防御反应中起着至关重要的作用。然而,对其在VSMC中的作用研究甚少。亚精胺合酶（spermidine synthase,SRM）是一种能催化合成亚精胺的重要酶,其广泛分布于生物体中。有研究表明亚精胺对心血管具有保护作用,比如能够延缓心肌衰老、减弱高盐饮食大鼠的高血压、改善小鼠动脉内皮细胞的氧化损伤以及减少动脉粥样硬化斑块中的脂质积聚等。然而,SRM是否与VSMC表型转化有关还有待探讨。环状RNA（circRNA）是一种通过反向剪接形成的具有共价闭合环状结构的RNA,广泛存在于真核细胞中。circRNA通过其mi RNA海绵作用、与蛋白质相互作用等方式调控基因表达,在肿瘤、免疫系统疾病、神经系统疾病中发挥重要作用。此外,circRNA还参与心血管疾病的发生发展。实验室前期研究发现PDGF-BB通过上调KLF4表达而促进circFAM53B-1和circFAM53B-2的形成,circFAM53B-1/2又通过抑制SRF表达抑制VSMC分化。但对于circFAM53B-1/2如何抑制SRF表达及VSMC分化尚不清楚,因此,本研究旨在观察circFAM53B-1/2抑制VSMC分化的机制。目的:研究circFAM53B-1/2抑制VSMC分化的机制。方法:1.用PDGF-BB（10 ng/m L）刺激VSMC 24 h,荧光原位杂交技术（FISH）检测circFAM53B-1/2的表达;免疫荧光检测Krüppel样因子4（KLF4）和血清应答因子（serum response factor,SRF）的表达。2.构建circFAM53B-1和circFAM53B-2表达载体并用其转染VSMC,24 h后收集细胞,Western blot检测SRF、α-肌动蛋白（SMA）、平滑肌蛋白22-α（SM22α）和Myocardin的表达;实时定量PCR（q RT-PCR）检测SRF和Myocardin的m RNA表达水平。构建SRF过表达载体,将其与circFAM53B-1/2过表达载体共同转染至VSMC,24 h后收集细胞,用Western blot检测SRF、SMA及SM22α的表达。3.在VSMC中过表达circFAM53B-1、circFAM53B-2以及KLF4并进行蛋白质谱检测;用Western blot及免疫荧光检测ISG15的表达;制备小鼠股动脉损伤模型,用免疫荧光检测ISG15表达情况。4.设计敲低ISG15的小干扰RNA和构建ISG15过表达载体,将二者分别转染至VSMC,使ISG15敲低或者过表达,用Western blot检测VSMC增殖/分化相关蛋白的表达;先转染靶向ISG15的小干扰RNA,再给予PDGF-BB（10 ng/m L）处理,用Western blot检测SMA及SM22α的表达。5.PDGF-BB（10 ng/m L）处理VMSC 24 h,对ISG15免疫沉淀的蛋白进行质谱分析,用免疫共沉淀（Co-IP）与免疫荧光检测ISG15与SRM的相互作用。6.设计敲低SRM的小干扰RNA和构建SRM表达载体,将二者分别转染至VSMC,使SRM敲低或者过表达,用Western blot检测VSMC增殖/分化相关蛋白的表达。结果:1.PDGF-BB通过KLF4-circFAM53B-1/2抑制SRF表达,从而抑制VSMC分化。免疫荧光染色和FISH染色证实PDGF-BB促进KLF4和circFAM53B-1/2表达,抑制SRF表达;Western blot结果显示过表达circFAM53B-1/2抑制SRF、SM22α和SMA蛋白表达,但不影响Myocardin蛋白表达;real-time PCR结果显示,过表达circFAM53B-1/2抑制SRF的m RNA表达,但不影响Myocardin的m RNA表达;过表达SRF能促进SM22α和SMA表达,并能部分逆转circFAM53B-1/2对SM22α和SMA表达的抑制作用。以上结果表明,PDGF-BB-KLF4-circFAM53B-1/2轴通过抑制SRF表达,抑制VSMC分化。2.circFAM53B-1/2能上调ISG15表达。我们前期在VSMC中过表达circFAM53B-1、circFAM53B-2以及KLF4进行蛋白质谱检测。对三者上调的蛋白取交集,发现三者同时上调ISG15和CST3表达。我们取上调倍数较大者ISG15进行验证。Western blot结果显示,在VSMC中过表达circFAM53B-1、circFAM53B-2或KLF4能促进ISG15表达;PDGF-BB亦能以时间和浓度依赖的方式促进ISG15表达;免疫荧光染色结果显示,PDGF-BB能显著增加ISG15的荧光信号;此外,在内膜发生损伤的小鼠股动脉中,ISG15的表达显著高于对照组。这些结果说明PDGF-BB-KLF4-circFAM53B-1/2轴能上调ISG15表达。3.ISG15抑制VSMC分化。敲低ISG15的表达能促进VSMC分化相关基因SRF、SM22α和SMA表达、抑制增殖相关基因KLF4、PCNA和Cyclin D1的表达;过表达ISG15能抑制分化标志基因表达,促进增殖相关基因表达;此外,敲低ISG15表达显著逆转PDGF-BB对分化标志基因SM22α与SMA的抑制作用。这些结果表明ISG15能抑制VSMC分化。4.PDGF-BB促进ISG15与SRM相互作用。ISG15是一种类泛素蛋白,可结合于蛋白质的赖氨酸残基使其发生ISG15化修饰,并不直接介导蛋白质的降解,而是参与细胞信号转导、基因表达调控等过程。在VSMC中,结合免疫沉淀、SDS-PAGE、银染以及蛋白质谱,初步发现,ISG15能与SRM相互作用。随后,进行免疫共沉淀和免疫荧光进行验证,发现PDGF-BB能促进ISG15与SRM相互作用。5.SRM促进VSMC分化。敲低SRM的表达能抑制VSMC分化相关基因SRF、SM22α和SMA表达、促进增殖相关基因KLF4和PCNA的表达;过表达SRM能促进分化标志基因表达、抑制增殖相关基因表达。以上结果表明,SRM能促进VSMC分化,然而SRM的促分化作用是否依赖于亚精胺的合成尚需进一步研究。此外,ISG15与SRM结合使之发生ISG15化修饰如何影响VSMC表型?是影响了SRM的表达还是改变了SRM的活性亦需进一步研究。结论:1.在VSMC中,PDGF-BB通过KLF4-circFAM53B-1/2抑制SRF表达,从而抑制VSMC分化。2.PDGF-BB-KLF4-circFAM53B-1/2通过上调ISG15表达而抑制SRF表达,从而抑制VSMC分化。3.ISG15能抑制VSMC分化、促进VSMC增殖,并能与SRM相互作用。4.SRM能促进VSMC分化、抑制VSMC增殖。