【摘 要】
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目的:天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)是一种单链核糖体失活蛋白。研究表明,天花粉蛋白具有广谱的抗肿瘤效应,但其抗肿瘤作用机制尚未被完全阐明。本研究拟从细胞自噬这一新的角度来进一步探究天花粉蛋白抗肿瘤作用机制,为天花粉蛋白抗宫颈癌乃至其抗肿瘤作用提供更多的研究基础和理论依据。方法:(1)MTT法检测TCS对宫颈癌HeLa细胞的抑制作用;(2)透射电镜观察TCS处理HeLa细胞后自噬囊
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目的:天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS）是一种单链核糖体失活蛋白。研究表明,天花粉蛋白具有广谱的抗肿瘤效应,但其抗肿瘤作用机制尚未被完全阐明。本研究拟从细胞自噬这一新的角度来进一步探究天花粉蛋白抗肿瘤作用机制,为天花粉蛋白抗宫颈癌乃至其抗肿瘤作用提供更多的研究基础和理论依据。方法:（1）MTT法检测TCS对宫颈癌HeLa细胞的抑制作用;（2）透射电镜观察TCS处理HeLa细胞后自噬囊泡和自噬小体的形成;（3）转染p EGFP-LC3真核表达质粒的HeLa细胞经TCS处理后,激光共聚焦显微镜下观察外源性表达的GFP-LC3荧光蛋白的定位改变;（4）Real-time PCR和半定量PCR检测TCS处理HeLa细胞后自噬相关基因在转录水平上的表达变化;（5）Western Blot检测TCS处理HeLa细胞后自噬和凋亡相关蛋白的变化情况;（6）流式细胞术检测联合运用TCS和自噬抑制剂后对细胞凋亡的影响。结果:（1）TCS能明显抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖,且呈浓度和时间依赖性;TCS作用HeLa细胞48h后其IC50值为（104.7±4.57）μg/m L。（2）经80μg/m L TCS分别处理HeLa细胞12h和24h后,透射电镜下观察到HeLa细胞中有明显的自噬囊泡和自噬小体形成,处理48h后可见明显的凋亡小体;（3）转染p EGFP-LC3真核表达质粒的HeLa细胞经TCS处理后,激光共聚焦显微镜下可观察到外源性表达的GFP-LC3荧光蛋白在胞浆中由弥散分布转向斑点状聚集分布;（4）Real-time PCR和半定量PCR结果显示,80μg/m L TCS处理HeLa细胞后自噬相关基因LC3B和Beclin1基因m RNA表达上调;（5）Western Blot结果显示,80μg/m L TCS作用HeLa细胞12h后自噬相关蛋白LC3BⅡ的表达开始升高,作用24h后凋亡相关蛋白PARP开始出现活性剪切带。剂量依赖性实验显示自噬相关蛋白LC3BⅡ的表达量随着TCS药物浓度的增加而增加。TCS与3MA联用可增加c-PARP蛋白的表达,（6）流式细胞术结果显示,TCS诱导HeLa细胞发生凋亡的比例随着药物浓度的增加而升高,TCS与3MA联用可增加细胞凋亡的比例。结论:TCS对宫颈癌HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用,TCS能同时诱导HeLa细胞发生细胞自噬和细胞凋亡,且TCS诱导的HeLa细胞自噬早于凋亡,抑制自噬可增加细胞凋亡的比例,这表明TCS诱导的细胞自噬是一种保护性细胞反应,与自噬抑制剂联用可增强TCS的抗宫颈癌作用。
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