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研究背景MAIT细胞（Mucosal-Associated Invariant T cells,MAIT,粘膜相关恒定T细胞）作为人体固有免疫的重要组分,参与抗细菌病毒、炎性反应、变态反应等,参与构建免疫防御的第一道防线,在自身免疫[1-7]、肿瘤免疫[8,9]、以及SARS-COV-2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2）[10-13]和肝脏[14-17]等疾病的中扮演重要角色。MAIT细胞在人体中非常丰富,在外周循环总T细胞占比高达10%[18,19],而占肝脏T细胞比例更是高达45%[20]。近些年来,越来越多的科学研究表明,MAIT细胞在肝脏稳态及相关疾病中发挥着不可或缺的作用。酒精性肝病（Alcoholic Liver Disease,ALD）患者肝脏MAIT细胞显著减低且伴随细菌负荷增加[21],酒精性肝硬化（Alcoholic Cirrhosis）患者外周循环和肝脏组织中MAIT细胞均显著减低,且体内、体外实验表明MAIT具有促进纤维化发生的作用[22]。非酒精性脂肪肝（Non-Alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD）患者外周循环 MAIT细胞减低,而肝脏MAIT细胞的数量增多,且肝脏MAIT细胞数量同NAFLD活动评分正相关[23]。自身免疫性肝脏疾病包括原发性胆汁性胆管炎（Primary Biliary Cholangitis,PBC）、原发性硬化性胆管炎（Primary Sclerosis Cholangitis,PSC）、自身免疫性肝炎（Autoimmune Hepatitis,AIH）以及上述三者任意组合的重叠综合征（Overlap Syndrome）。MAIT细胞同样在乙型病毒型肝炎[24-26]、丙型病毒型肝炎[27-30]、自身免疫性肝炎[5]、肝实质细胞癌[9]、原发性胆汁性胆管炎[31]、肝纤维化[22]中的具有重要作用。研究目的本研究拟在PBC患者中,探索CD3+CD8+CD161high TCR Vα7.2+的MAIT细胞在外周循环中显著减低,而在肝脏异常聚集的可能机理;探究PBC患者MAIT细胞激活、促炎、促杀伤免疫表型的潜在作用机制,初步探究MAIT细胞在PBC发病机制中的潜在作用。研究方法招募55名PBC患者和性别、年龄匹配的69名健康志愿者以及8名肝血管瘤患者。我们通过流式细胞技数,分析外周循环中MAIT细胞数量比例,MAIT细胞趋化因子受体谱,以及MAIT细胞产生的细胞因子等免疫表型。使用免疫荧光法测定分析肝脏组织中的MAIT细胞数量。基于Transwell系统开展MAIT细胞趋化因子及其受体的研究。通过ELISA法测定样本血浆中IL-18的表达水平,流式检测IL-18刺激后的MAIT细胞产生的细胞因子等。研究结果1.PBC患者外周循环中MAIT细胞显著低于健康对照组（3.0±3.2%vs.9.4±8.0%,p<0.01）,且与碱性磷酸酶水平呈负相关（r=-0.3209,p<0.05）。2.免疫荧光染色提示PBC患者肝脏组织MAIT细胞显著增多。3.PBC患者的MAIT细胞比健康对照表达更高水平的CXCR4（84.8±18.0%vs.58.7±11.4%,p<0.01）。4.CXCR4对应的配体,CXCL12在PBC患者肝脏中的表达较高。5.同健康对照组相比,体外实验提示CXCL12可增强PBC患者的MAIT细胞趋化（70.4±6.8%vs.52.2±3.5%,p<0.01）,且此效应可被CXCR4拮抗剂所减弱。6.PBC 患者的 MAIT 细胞可产生更多的 IFN-γ（88.3±4.2%vs.64.2±10.1%,p<0.01）,TNF-α（93.0±1.1%vs.80.1±5.3%,p<0.01）,Granzyme B（89.3±3.3%vs.72.1±7.0%,p<0.01）以及 perforin（46.8±6.6%vs.34.8±7.7%,p<0.05）。7.PBC患者的MAIT细胞表达更高水平的IL18-Rα（83.8±10.2%vs.58.3±8.7%,p<0.01）。PBC患者血浆IL-18 水平显著高于健康对照组（286.8±75.7 pg/mL vs.132.9±78.1 pg/mL,p<0.01）。8.体外实验提示IL-18可促进MAIT细胞IFN-γ的产生（74.9±6.6%vs.54.7±6.7%,p<0.01）,且阻断IL-18R可减弱IFN-γ的产生（68.6±8.3%vs.43.5±4.2%,p<0.01）。研究结论PBC患者的MAIT细胞通过CXCL12-CXCR4介导的趋化作用导致外周循环显著减低、肝脏异常升高。PBC患者血浆中高表达的IL-18可促进MAIT细胞产生更多的促炎因子进而参与PBC肝脏炎性环境。靶向MAIT细胞可为PBC发病机理的理解及临床治疗带来新的思路。研究背景原发性胆汁性胆管炎（Prirmary Biliary Cholangitis,PBC）是一种慢性肝内胆汁淤积性自身免疫性疾病,伴有自身抗原免疫耐受失衡。超过90%的PBC患者血清学检测可有抗线粒体抗体（Antimitocondrial antibodies,AMAs）阳性,临床上常有胆汁淤积的肝脏酶学异常,即碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）异常升高,伴或不伴Y-谷氨酰转肽酶（gamma-glutamyl transferase,GGT）的异常升高。PBC突出表现为慢性肝内小胆管淋巴细胞性非化脓性肉芽肿样浸润破坏,包括CD38+B细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞及巨噬细胞在内的多种淋巴细胞族群,参与PBC病理损伤。前期本课题组在临床诊疗中发现PBC聚集的家系,并通过对两个汉族PBC家系进行全外显子测序,筛查到了一些PBC的易感基因。去除同义突变、非编码区的突变,着重关注错义、缺失、移码突变,结合生物学分析预测这些基因的有害性,在家系内找寻共分离（Co-segreation）基因。最终确定在C57BL/6J背景的小鼠中通过CRISPR/Cas9技术进行基因编辑,敲入PTK2B以模拟临床PBC家系发病关键基因改变,观测基因PTK2B在小鼠体内是否引起PBC样改变,并初步探究其相关发病机制。研究目的本研究拟研究成功进行基因编辑敲入PTK2B基因的C57BL/6J背景小鼠。在无特定病原体（Specefic Pathogen Free,SPF）环境中按规范进行饲喂,观察不同基因型（WT/WT,WT/KI,KI/KI）的雌性和/或雄性C57BL/6J背景小鼠能否自发出现PBC样的表现,并进一步探究PTK2B基因在PBC发病中的潜在作用机制。研究方法本课题组前期通过全外显子测序技术在PBC家系中筛查到了共分离基因PTK2B,并通过CRISPR/Cas9技术成功制作出PTK2B Knock-in（KI）小鼠。通过免疫组化染色、H&E病理染色、免疫荧光染色,观察不同周龄、不同性别、不同组别（WT/WT,WT/KI,KI/KI）小鼠的肝脏病理情况,并评估不同组织器官（包括肝脏、脾脏、脑、心脏、结肠、肾脏、肺及膀胱组织）的病理学变化,评估肝脏浸润的主要淋巴细胞亚群并检测关键活化分子。通过天狼猩红染色评估小鼠肝纤维化情况。通过ELISA检测小鼠血清自身抗体ANAs（Antinuclear antibodies）、AMAs表达情况,检测小鼠血清ALP水平改变,检测相关细胞因子表达水平。通过流式细胞技术评估小鼠肝脏、脾脏、外周淋巴结及外周血中淋巴细胞亚群变化情况。从组织病理学、血清自身抗体及肝脏功能变化评估小鼠是否发生了 PBC样改变。检测PBC样表征的小鼠免疫学异常,并初步探索PTK2B介导小鼠自然发生PBC的致病机制。研究结果1.自然发育至8周龄的雌性C57BL/6J的KI/KI小鼠血清ANAs水平显著高于WT/KI 组（261±35 vs.159±35U/mL,p<0.05）,而 WT/KI 组与 WT/WT组相比无显著差异（159±35 vs.129±43U/mL,p>0.05）。2.自然发育至12周龄的雌性KI/KI小鼠血清AMAs显著高于WT/KI组小鼠（3,924±769vs.1,972±632U/mL,p<0.05）;WT/KI组小鼠血清AMAs水平同WT/WT组小鼠差异无显著统计学意义（1,972±632vs.1,939±379U/mL,p>0.05）。雄性KI/KI组小鼠血清AMAs水平同WT/KI组比,差异无统计学意义（3,087±1,532 vs.1,549±588U/mL,p>0.05）;雄性 WT/KI 组小鼠同 WT/WT组相比,小鼠血清AMAs水平差异无显著的统计学意义（1,549±588 vs.1,703±474U/mL,p>0.05）。3.雌性KI/KI小鼠出现明显的肝内小胆管增生及淋巴细胞浸润,且具有肝脏器官特异性;雄性KI/KI小鼠变化不显著。4.雌性KI/KI小鼠血清ALP水平显著高于WT/KI组（236±55 vs.142±43U/L,p<0.05）,高于 WT/WT组（236±55vs.121±37U/L,p<0.05）;WT/KI组同WT/WT组的血清ALP水平相比,差异无统计学意义（142±43 vs.121±37,p>0.05）。5.雌性KI/KI小鼠肝脏、脾脏、淋巴结及外周血免疫学异常。雌性KI/KI小鼠肝脏浸润的 CD19+B细胞（44.7±1.7%vs.32.6±2.2%,p<0.05）,CD3+T细胞（50.8±1.7%vs.38.9±3.2%,p<0.05）,CD8+细胞（14.3±2.8%vs.7.5±1.3%,p<0.05）及 NK细胞（MFI:586.1±64.6 vs.469.1±18.6,p<0.05）均显著高于WT/WT组;同雌性WT/WT组小鼠相比,雌性KI/KI小鼠脾脏CD3+T细胞显著增多（32.2±6.5%vs.19.6±5.8%,p<0.05）,CD3+CD4+细胞显著增多（23.7±4.9%vs.16.5±3.6%,p<0.05）,CD3+CD8+细胞显著增多（10.6±1.5%vs.6.2± 1.6%,p<0.05）,CD19+B细胞显著增多（70.1±9.7%vs.57.8±6.2%,p<0.05）;同雌性WT/WT组小鼠相比,雌性KI/KI小鼠淋巴结中CD3+T细胞显著减低（28.4±3.1%vs.73.1±0.7%,p<0.05）,CD19+B细胞显著增多（69.8±3.3%vs.26.4±2.3%,p<0.05）,CD3+CD4+细胞显著减少（12.8±1.2%vs.42.0±3.2%,p<0.05）,CD3+CD8+细胞显著减少（12.3±3.1%vs.28.8±0.7%,p<0.05）;与雌性WT/WT组小鼠相比,雌性KI/KI小鼠外周血单个核细胞中CD3+T细胞显著减低（57.6±3.5%vs.78.7±3.3%,p<0.05）,CD19+B细胞显著增多（40.6±3.6%vs.20.1±3.7%,p<0.05）,CD3+CD4+细胞显著减少（29.3±1.9%vs.45.1±2.4%,p<0.05）,CD3+CD8+细胞显著减少（25.6±2.2%vs.31.3±0.9%,p<0.05）。6.雌性KI/KI小鼠血清MCP-1水平较WT/WT组小鼠显著升高（2,209±412pg/mL vs.1,187±89pg/mL,p<0.05）。7.PTK2B介导雌性KI/KI小鼠肝脏淋巴细胞浸润,CD38+B细胞在PBC小鼠发病中具有重要作用。雌性KI/KI小鼠肝脏浸润的细胞包括CD20+B细胞、CD3+T细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、F4/80+巨噬细胞及Ly6G+粒细胞。门静脉周围浸润大量的CD38+CD20+B细胞参与小鼠发生PBC。8.雌性KI/KI小鼠肝脏门静脉周围CD38+CD20+B细胞显著富集。9.雌性KI/KI小鼠外周血CCR2+细胞显著减低（33.8±12.8%vs.4.8±6.5%,p<0.05）,肝脏 CCR2+细胞显著增加（31.7±6.2%vs.20.4± 2.2%,p<0.05）。雌性KI/KI小鼠肝脏CCR2+CD20+细胞显著浸润。研究结论PBC家系发现的共分离基因PTK2B成功敲入C57BL/6J小鼠,雌性小鼠自发出现肝脏特异性PBC样表征。雌性小鼠血清自身抗体ANAs及AMAs 阳性,ALP异常升高。同临床PBC诊断类比相符合。此外肝脏CD38+CD20+B及CCR2+CD20+B细胞显著浸润增多参与PTK2B介导的小鼠PBC发病。