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背景及目的结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，其治疗目前仍以手术为主。虽然肿瘤被完全切除,但术后仍可能发生播散性转移，术后5年生存率较低，约50%，近半数病例术后2年出现肿瘤的复发和转移。氯离子通道蛋白-1(Chloride intracellular channel1, CLIC1)是新近发现的一种离子通道蛋白，它属于氯通道蛋白家族中的一种，最近研究表明CLIC1在肝癌、胆囊癌和胃癌等肿瘤组织中高表达，并与胆囊癌及胃癌的转移相关，在结直肠癌中也检测到CLIC1的高表达，但是CLIC1是否与结直肠癌的转移有关未作相关研究。因此本课题从以下三个方面对CLIC1与结肠癌的转移作一初步研究：(1)CLIC1在结肠癌组织及癌旁组织中的表达有无差异，CLIC1的表达结肠癌患者与患者的性别、年龄、肿瘤大小、有无淋巴结转移及TNM分期等是否有关；(2)CLIC1能否通过调控性容积下降（RVD）介导结肠癌的转移；(3)CLIC1在缺氧-再加氧条件下与结肠癌转移及其机制，从而为结肠癌的防治提供新的思路和方法。研究方法与结果第一部分CLIC1mRNA及蛋白在结肠癌表达及临床意义方法：收集2011年1-6月本院手术切除的54例结肠癌和相应癌旁组织(距肿瘤边缘＞5cm)标本。采用逆转录RT-PCR检测CLIC1mRNA在结肠癌组织及相应癌旁组织中的表达情况，免疫组化检测CLIC1蛋白在结肠癌组织的表达。比较CLIC1mRNA在结肠癌及癌旁组织的表达差异，分析CLIC1蛋白的表达与患者年龄、性别、肿瘤的大小、部位、分化程度、淋巴结转移及TNM分期等方面的关系。结果：CLIC1mRNA在54例患者癌组织中表达的阳性率为85.18%(46/54)；在相应癌旁组织中表达的阳性率为90.74%(49/54)，两者CLIC1mRNA的阳性表达率之间比较无明显差异(P>0.05)。CLIC1mRNA在结肠癌及癌旁组织中的扩增水平别为0.6576±0.043和0.2808±0.027，两者比较P<0.01。结肠癌组织中CLIC1蛋白的表达水平高于癌旁组织，CLIC1蛋白表达在患者肿瘤的浸润程度(P<0.05)和有无淋巴转移(P<0.05)存在差异；在TNM分期(P<0.01)差异有显著性；而CLIC1蛋白表达在患者的年龄、性别、肿瘤的大小、部位、分化程度方面无明显差异(P>0.05)。第二部分CLIC1介导RVD促进结肠癌迁移及侵袭方法：我们用人结肠癌细胞株LOVO和HT29作为细胞模型来研究氯离子通道蛋白-1(CLIC1)在结肠癌转移中的作用。用低渗液分别刺激诱导LOVO和HT29细胞的调控性细胞容积下降(RVD)过程，比较两者RVD的差异；然后CLIC1特异性抑制剂IAA94观察对LOVO和HT29细胞RVD的影响。分别采用CLIC1特异性抑制剂IAA94和CLIC1SiRNA转染，研究它们对结肠癌细胞迁移及侵袭的影响。通过RT-PCR、Western Blot及细胞免疫荧光检测CLIC1mRNA及其蛋白的表达。结果：当两种细胞暴露于低渗溶液时，高转移潜能的LOVO和低转移潜能的HT29细胞细胞，与在等渗溶液中比较细胞容积分别增加45.6±1.8％(P <0.01)和46.8±2.3％(P <0.01)。在肿胀高峰后，细胞容积逐渐下降。LOVO细胞标准化细胞容积从峰值145.6±1.8％(低渗5分钟)，下降至最小值109.8±3.0％(低渗17分钟)(P <0.01)；HT29细胞标准化细胞容积，从峰值146.8±2.3％(低渗5分钟)，在低渗16分钟下降至最小值120.5±2.1％(低渗16分钟)(P <0.01)。HT29和LOVO细胞的RVD值分别为61.4±2.2％和81.09±1.9％，两者比较差异有显著性(P <0.01)。特异的氯离子通道蛋白-1阻滞剂IAA94(20或40μmol/L)可抑制结肠癌细胞的RVD、迁移和侵袭能力。这些效应呈剂量依赖性。小RNA(SiRNA)干扰下调CLIC1的表达亦可抑制LOVO和HT29细胞的迁移和侵袭能力。CLIC1蛋白均主要表达在两种类型细胞的细胞膜，表明可发挥氯离子通道功能；与HT29细胞相比，CLIC1mRNA和蛋白的表达在LOVO细胞均高表达(P <0.01)。氯离子通道蛋白-1特异阻滞剂IAA94(20或40μmol/L)对两种细胞的CLIC1mRNA和蛋白表达水平均无明显的影响。第三部分CLIC1通过ROS/ERK信号通路介导结肠癌LOVO细胞的迁移及侵袭方法：缺氧-再加氧(H-R)培养处理人结肠癌LOVO细胞，荧光探针DCF-DA检测检测细胞内活性氧(ROS)水平，伤口愈合及Transwell细胞侵袭试验分别检测对LOVO细胞迁移及侵袭的影响。NADPH氧化酶抑制剂(DPI)、抗氧化剂(NAC)、ERK抑制剂(PD98059)及氯离子通道蛋白-1抑制剂(IAA94)分别处理H-R条件下LOVO细胞，检测对细胞ROS产生、迁移及侵袭的影响，Western blot检对ERK、p-ERK、MMP-2及MMP-9蛋白表达的影响。结果：与常氧培养组(N)比较，H-R处理后LOVO细胞内的ROS明显提高(P <0.01)，细胞的迁移及侵袭能力明显增强(分别P <0.05，P <0.01)， p-ERK、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显上调。与H-R组比较，DPI(15μmol/L)组; NAC(30mmol/L)组; PD98059(50μmol/L)组或IAA94(20和40μmol/L)组细胞ROS产生、迁移及侵袭能力明显减弱(P <0.01)， p-ERK、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平亦明显减少。全文结论(1)CLIC1mRNA及其蛋白在结肠癌组织中高表达，CLIC1蛋白表达在肿瘤的浸润程度、有无淋巴转移和TNM分期方面存在显著差异；而在患者的年龄、性别、肿瘤的大小、部位、分化程度方面差异无显著性。(2)RVD与结肠癌细胞的转移潜能有关；CLIC1特异性抑制剂IAA94抑制结肠癌LOVO及HT29细胞的RVD、迁移及侵袭；CLIC1SiRNA转染两种细胞亦可抑制结肠癌细胞的迁移及侵袭能力；CLIC1可通过调控结肠癌细胞的RVD介导结肠癌的转移。(3)H-R可通过提高细胞内的ROS产生促进结肠癌的迁移及侵袭能力；CLIC1可通过ROS/ERK信号途径调控结肠癌LOVO细胞的迁移及侵袭。