霍乱是一种古老且流行广泛的急性肠道感染疾病,临床表现为大量米泔样大便,严重时候导致病人休克甚至死亡。革兰氏阴性细菌霍乱弧菌是引起霍乱的病原体,其致病能力主要由霍乱毒素和毒素共调节菌毛所介导。LysR型转录调控因子是广泛存在于原核生物中的一类DNA结合蛋白家族,该家族蛋白虽然结构高度保守,但调控范围涉及生物代谢、群体感应、毒素产生、固氮和游动性等多方面。抗氧化调节子OxyR是LysR型转录调控蛋白家族的成员之一,大小约34KDa,是菌株抵抗氧化损伤作用的最重要的防御屏障。对于OxyR调节子的研究在大肠杆菌、绿脓杆菌等细菌中进行得比较广泛和深入,而在霍乱弧菌中尚未有研究报道,因此本实验以霍乱弧菌OxyR调节子作为研究对象。采用框内敲除方法构建霍乱弧菌oxyR突变株,发现有氧条件下培养时该突变株具有严重的生长缺陷,而霍乱弧菌野生株的培养物上清液可以弥补这种生长缺陷,使oxyR突变株恢复正常生长；继而通过一系列实验证明上清液中发挥作用的的活性物质是与抗氧化相关的蛋白质,同时检测到牛肝过氧化氢酶也具有弥补oxyR突变株生长缺陷的活性,推测有氧条件下霍乱弧菌oxyR突变株的生长缺陷是由外界环境中的氧分压所导致,上清液中发挥作用的的活性物质可能是与抗氧化相关的酶类。构建霍乱弧菌中几种抗氧化功能基因(katG、katB、vc2637-8)的缺失突变株,检测突变株上清液是否能够帮助.oxyR突变株恢复正常生长,结果发现KatG、KatB蛋白是存在于上清液中的主要活性物质；利用镍柱纯化带有His标签的KatG、KatB融合蛋白并添加到oxyR突变株的培养液中,证实了二者确实具有弥补oxyR突变株生长缺陷的活性；以lux作为报告基因构建目的基因表达分析的检测菌株,通过冷光检测发现OxyR对katG、katB的表达不具有调控作用,因此证明了为何oxyR突变株上清液具有与野生株上清液相同的弥补oxyR突变株生长缺陷的功能；通过在霍乱弧菌体内超量表达带有Flag标签的KatG、KatB融合蛋白,以霍乱弧菌确定的胞内蛋白HapR作为对照,通过Western blotting检测证实这两个蛋白均是通过细胞裂解方式释放到上清液中从而发挥作用的。论文进一步研究了霍乱弧菌oxyR、katG、katB、vc2637-8等抗氧化基因缺失株的生理功能。通过检测生长情况,发现除oxyR缺失导致菌株严重的生长缺陷之外,katG-katB-vc2637-8三重基因缺失突变株的生长也会受到一定程度的抑制；通过检测突变株对H202的敏感性,发现抗氧化基因缺失会导致菌株对H2O2敏感性提高；通过检测突变株的定殖能力,发现抗氧化基因的缺失不影响霍乱弧菌在乳鼠肠道的正常生长与定殖。综上所述,在体外条件下,OxyR调节子对于霍乱弧菌抗氧化能力整体水平的调控十分重要,是保证菌株在有氧条件下正常生长的关键。在后面的研究中,有必要对霍乱弧菌的OxyR抗氧化调控系统进行更深入的研究,筛选受OxyR蛋白调控的功能基因。