副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus)是嗜盐性、革兰氏阴性杆菌,广泛分布于海水、河口环境中,特别是海鲜类和盐渍类的产品中,是一种重要的食源性致病菌,可引起食物中毒和急性腹泻病。生物膜是微生物细胞及其产生的细胞外大分子多聚物所形成的一种特殊细菌群落,它也是细菌抵抗不利环境、产生耐药性并导致持续感染的重要方式。生物膜一旦形成,使用一般的抗生素、消毒剂很难去除,在医疗和食品安全等领域带来很大的风险。因此,开发天然的、安全的抗生物膜制剂具有重要的意义。本研究采用结晶紫染色法、平板菌落计数、微量肉汤二倍稀释法、XTT减量法、苯酚-硫酸法、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察等方法,分析不同条件下副溶血弧菌生物膜的形成特性和食品防腐剂处理对生物膜的抑制和清除作用。研究的主要内容和结果如下:1.以副溶血弧菌标准菌株ATCC17802、J5421以及实验室分离鉴定得到的24株副溶血弧菌作为研究对象,分析其形成生物膜的能力,结果21号菌株和22号菌株成膜能力较强。选择副溶血弧菌ATCC17802、J5421和21号、22号菌株为研究对象,分析不同菌株、时间、温度、pH、盐浓度、材料等因素对生物膜的形成的影响。结果发现,培养时间为2 d时,四株菌的成膜能力均最高。pH在5~9时有利于副溶血弧菌生物膜形成。高浓度的NaCl有利于副溶血弧菌ATCC17802、J5421、22号菌株生物膜的形成,其中添加3%的NaCl时生物膜形成量最高;低浓度的NaCl有利于副溶血弧菌21号菌株生物膜的形成,其中添加1.5%的NaCl生物膜形成量最高。比较四种不同的材料(玻片、不锈钢片、蟹壳、鱼鳞)上副溶血弧菌粘附能力,发现副溶血弧菌在蟹壳上粘附能力最强。2.进一步研究壳聚糖、山梨酸钾、脱氢乙酸钠和ε-聚赖氨酸(ε-PL)对副溶血弧菌ATCC17802和J5421菌株生物膜的抑制作用。结果发现壳聚糖对副溶血弧菌的抑菌能力最强,其MIC和MBC分别为1.25 mg/m L和2.5 mg/mL;经过1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC壳聚糖溶液处理后,其抑制率分别为68.37%、34.12%、14.38%;菌体的代谢活性抑制率分别为47.74%、34.34%和17.17%;胞外多糖抑制率为76.32%、62.57%和29.38%。结果表明亚抑菌浓度下的壳聚糖能够明显抑制生物膜的形成,降低细菌的代谢活性。经1/2MIC壳聚糖+1/4MIC山梨酸钾+1/2MIC脱氢乙酸钠+1/4MICε-聚赖氨酸复配后对生物膜的抑制率达到79.54%,菌体的代谢活性抑制率为59.72%,胞外多糖抑制率为85.44%。亚抑菌浓度的防腐剂之间复配显著增强了单独使用一种防腐剂对生物膜的抑制效果。3.分析研究了壳聚糖、山梨酸钾、脱氢乙酸钠和ε-聚赖氨酸(ε-PL)对副溶血弧菌ATCC17802和J5421菌株生物膜的清除作用。结果发现经过4MIC、2MIC、MIC壳聚糖溶液处理4 h后,其清除率分别达到86.94%、61.43%、46.94%;菌体的代谢活性减少率分别为76.10%、63.11%、52.20%;胞外多糖减少率为81.43%、69.63%、61.12%。结果表明壳聚糖对副溶血弧菌的清除效果最强,随着壳聚糖浓度的增加以及作用时间的延长,壳聚糖对副溶血弧菌生物膜的清除作用显著增强。高浓度的壳聚糖可以有效的清除成熟的生物膜。进一步通过4MIC壳聚糖+MIC山梨酸钾+2MIC脱氢乙酸钠+2MICε-聚赖氨酸复配大大增强了清除成熟生物膜的效果。防腐剂复配对成熟生物膜的菌体杀菌率为96.34%,代谢活性减少率为85.64%,胞外多糖减少率为89.71%。研究表明防腐剂之间具有协同作用,复配比单一使用效果更佳。4.荧光显微镜观察发现生物膜活菌数减少,细菌总量减少;激光共聚焦显微镜观察表明,处理后的生物膜受到了严重的破坏,胞外分泌物质大量减少,生物膜的厚度减少,细菌处于分散状态,可以很直观的看到生物膜的清除效果。