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目的:本课题旨在研究Notch信号通路阻断剂γ-分泌酶抑制剂(GSIs)DAPT作用于结肠癌细胞株HT-29后,初步探索Notch信号通路中受体Notch4、配体DLL1与结直肠癌肿瘤干细胞标记物ALDH1在细胞中的表达情况及相关性,为结直肠癌的防治提供理论依据。方法:本次实验的研究对象为结肠癌HT-29细胞株。首先在条件为37℃,20%O2,5%CO2和95%湿度的培养箱中,体外培养HT-29细胞,提取对数生长期细胞,分别用于以下各步试验。(1)用细胞免疫组化检测HT-29细胞中ALDH1、Notch4及DLL1表达的情况及不同浓度DAPT对HT-29细胞中ALDH1、Notch4及DLL1表达的影响,图像分析系统计量。(2)不同DAPT浓度(0、5、10、20、40、80μmol/L)作用于结直肠癌HT-29细胞,倒置显微镜下观察不同浓度DAPT对HT-29细胞形态影响;用MTT比色法检测不同浓度DAPT对HT-29细胞增殖的抑制作用。(3)运用real-time PCR技术、Western-Blot技术检测DAPT作用HT-29细胞前后,ALDH1、Notch4及DLL1的m RNA和蛋白质的表达变化及相关性。结果:(1)细胞免疫组化检测结果显示ALDH1、Notch4、DLL1在HT-29细胞中均有表达,当加入DAPT后,与对照组相比ALDH1、Notch4、DLL1蛋白表达降低(P<0.05),且随着DAPT浓度的增加降低更明显,存在浓度依赖性。(2)不同DAPT终浓度(0、5、10、20、40、80μmol/L)作用于结肠癌HT-29细胞,显微镜下观察HT-29细胞具有典型的凋亡细胞形态学特征。MTT法检测各浓度组分别与对照组相比较,对HT-29细胞的生长抑制率:24h细胞生长抑制率分别为0%、0.22%、5.85%、11.41%、13.82%、18.59%;48h分别为0%、6.06%、16.8%、25.44%、44.25%、56.73%;72h分别为0%、6.9%、4.86%、27.6%、51.59%、67.78%。随着DAPT作用浓度和时间的增加,其对HT-29细胞增殖抑制率显著增大,实验组与对照组比较有统计学差异(P<0.05),呈时间和剂量依赖性。浓度为40、80μmol/L的DAPT在48h、72h分别与24h比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)20、40μmol/LDAPT作用HT-29细胞48小时后,ALDH1、Notch4及DLL1的m RNA和蛋白的表达情况及相关性:在HT-29细胞中ALDH1表达在Notch4和DLL1表达下调时也下调(P<0.05),且ALDH1、Notch4及DLL1的蛋白表达在药物浓度20与40μmol/L之间比较也有统计学意义(P<0.05)。ALDH1m RNA与Notch4m RNA表达有关(P<0.05);Notch4m RNA与DLL1m RNA表达有关(P<0.05);ALDH1m RNA与DLL1m RNA表达无关(P<0.05)。ALDH1与Notch4的蛋白表达有关(P<0.05);Notch4与DLL1的蛋白表达有关(P<0.05);ALDH1与DLL1的蛋白表达无关(p>0.05);可见,ALDH1、Notch4及DLL1的m RNA和蛋白表达差异的统计学意义一致,三者之间可能存在相关性。结论:(1)Notch4、DLL1和ALDH1在人的结肠癌HT-29细胞中均有表达。(2)DAPT能抑制结肠癌细胞HT-29的体外增殖,这种抑制作用在一定范围内具有时间和浓度的依赖性。(3)在结肠癌细胞HT-29中高表达的ALDH1,经Notch信号通路抑制剂DAPT作用后,ALDH1的表达随着Notch信号通路中的Notch4和DLL1的表达下调发生相应的下调。(4)Notch4、DLL1与ALDH1在Notch信号通路调节结肠癌HT-29细胞中可能存在相互关系。