第一部分 下呼吸道感染病原悬浮芯片检测方法的临床应用研究目的:随着近年来非典型肺炎的爆发流行,下呼吸道感染病原学越来越复杂,早期诊断病原对预后至关重要,悬浮芯片技术为近年来发展迅速可用于高通量、快速筛查多种病原的检测技术,本研究拟利用课题组研发的悬浮芯片检测技术对临床下呼吸道标本进行检测,并与金标准比较以进一步验证该法检测的临床价值。方法:收集2012年3月至2016年3月福建省多中心研究(包括福建省立医院,莆田学院附属医院,三明市第一医院,武夷山市立医院四家医院)的呼吸科住院急性下呼吸道感染患者819例,共采集到819份痰标本,利用悬浮芯片技术同时进行6种细菌(金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌)及12种病毒检测(人巨细胞病毒、腺病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、甲型流感病毒H5型、甲型流感病毒N1型、人偏肺病毒、人博卡病毒)筛查及检测,细菌检测以传统细菌培养法为金标准、病毒检测以实时定量荧光PCR(Real-Time PCR)检测作为金标准。分析悬浮芯片技术的灵敏度特异度,阳性预测值和阴性预测值以及准确度,判断该技术在临床中的应用价值。结果:悬浮芯片快速检测技术可在7～8小时内对96份标本进行18种病原体检测。819份标本检测结果呼吸道病原体的阳性率为62.27%(510/819),细菌致病菌的阳性率为43.22%(354/819),病毒的阳性率为33.21%(272/819)。其中最常见的病原是:金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌,其悬浮芯片检测的阳性率分别为5.13%,13.19%,13.36%,5.86%,15.87%,5.49%显著高于传统痰培养法(痰标本阳性率分别为 2.08%,0.73%,1.83%,2.08%,2.81%,0.61%,P<0.05)。819份标本采用悬浮芯片技术进行人巨细胞病毒、腺病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、甲型流感病毒H5型、甲型流感病毒N1型、人偏肺病毒、人博卡病毒检测结果灵敏度分别为 65.31%,26.67%,12.5%,100%,57.14%,42.00%,N/A,65.63%,N/A,50%,33.33%,100%。特异度分为 93.20%,99.75%,99.38%,99.51%,99.50%,99.63%,N/A,91.03%,99.15%,99.76%,99.75%,99.63%。以悬浮芯片技术检测细菌的阳性预测值11.37%(8.64%～14.61%),阴性预测值99.32%(99.04%～99.54%),准确度 90.97%(90.14%～91.76%)。检测病毒的阳性预测值 54.6%(48.93%～60.19%),阴性预测值98.8%(98.56%～99.01%),准确度 97.38%(97.05%～97.69%)。结论:本课题组研发的悬浮芯片检测方法具有高通量、快速检测的特点,该方法具有较高的敏感度及特异度,有望成为临床呼吸道病原体检测的一种新方法,值得在临床推广应用。第二部分福建省下呼吸道感染住院患者常见病原学分析目的:应用悬浮芯片检测下呼吸道感染患者的病原体,分析福建省下呼吸道感染患者病原学的分布概况及临床特征,以期指导临床治疗。方法:收集2012年3月至2016年3月福建省立医院,莆田学院附属医院,三明市第一医院,武夷山市立医院四家医院呼吸科住院下呼吸道感染患者819例,采用悬浮芯片技术检测病原体,同时结合临床信息进行数据统计分析。结果:下呼吸道感染住院患者感染的最常见细菌前三名为铜绿假单胞菌(PA),肺炎链球菌(SP),肺炎克雷伯杆菌(KP),病毒前三位为甲型流感病毒(Flu-A)、人巨细胞病毒(HCMV)、腺病毒(AD)。分析患病率最高的前三种疾病,社区获得性肺炎患者(CAP)502例其中检测出细菌前三位为PA(14.14%),SP(13.14%),KP(11.55%),病毒前两位分别Flu-A(17.13%)和HCMV(12.95%)。慢性阻塞性肺疾病急性加重患者(AE-COPD)204例其中检测出细菌前三位为SP(16.18%),PA(12.25%),KP(11.27%),病毒前两位分别 Flu-A(17.65%)和 HCMV(15.69%),支气管扩张患者(AEB)113例其中检测出细菌前三位为PA(30.09%),KP(10.62%),SP(7.96%),病毒前两位分别 Flu-A(21.24%)和 HCMV(14.16%)。将 819 例下呼吸道患者分为四组:113例细菌和病毒的混合感染、241例单纯细菌感染、159例单纯病毒感染,306例未检出组的临床资料比较。在性别分布、基础疾病、有无喘息及肺外并发症等方面差异无统计学意义(P>0.05);但混合感染组热程长,且更容易发生胸腔积液,与其余三组差异有统计学意义(P均<0.05)。在影像学表现方面,混合感染组更容易出现大片状阴影,胸腔积液多出现于肺部影像学呈大片状密度增高者,单纯细菌感染组及单纯病毒感染则以引起小片状密度增高影为主,四组间差异具有统计学意义(P<0.05)。细菌和病毒混合感染组下呼吸道感染者病程中(发病期)白细胞水平、中性粒细胞比值和CRP平均值明显高于其余三组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:福建省下呼吸道感染病原常见致病细菌以铜绿假单胞菌,肺炎链球菌,肺炎克雷伯杆菌为主,病毒以甲型流感病毒,人巨细胞病毒为主,通过分析病原学的分布及临床特征可以指导临床用药。第三部分社区获得性肺炎住院患者病原体预测模型的建立目的:从819例下呼吸道感染患者中筛选到住院502例社区获得性肺炎患者,根据临床信息利用统计学方法建立病毒/细菌感染预测模型,有助于早期判断社区获得性肺炎的住院患者病原及早期针对性抗病原治疗。方法:根据病原检测结果,将502例社区获得性肺炎社区获得性肺炎患者分为单纯细菌感染组(Ⅰ)138例、单纯病毒感染组(Ⅱ)104例、细菌病毒混合感染组(Ⅲ)64例和病原检测阴性组(Ⅳ)196例,收集患者的基本资料和既往病史和用药史,患者的症状和体征,实验室检查和影像学检查资料等。多组正态资料间的比较采用方差分析(ANOVA),两两比较采用SNK法检验;多组非正态的定量资料间的比较采用Kruskal-Wallis H检验,两两比较采用Nemenyi法检验;多组定性资料的比较采用卡方检验。以P ≤0.05为差异有统计学意义。在预测模型分析中,根据单因素logistic回归分析筛选的相关变量进行多元logistic回归分析,建立概率预测方程,并使用列线图对预测方程进行可视化做图。结果:我们将纳入Ⅰ组和Ⅳ组的患者建立单纯细菌感染预测模型。通过单因素logistic回归分析的结果将有统计学意义的因素进行多因素logistic回归分析 得 出 其 独 立 因 素 建立 方 程:P(y=1)=exp(1.056+1.634× 咳嗽+0.696× 高血压+0.508× 入院前使用抗生素+0.530× CRUB-65)/1+exp(1.056+1.634×咳嗽+0.696×高血压+0.508×入院前使用抗生素+0.530×CRUB-65)纳入Ⅱ组和Ⅳ组的患者建立单纯病毒感染预测模型。通过单因素logistic回归分析的结果将有统计学意义的因素进行多因素logistic回归分析得出其独立因素建立方程:P(y=1)=exp(0.582+1.235× 咳痰+0.885× 高血压+0.677×CRUB-65)/1+exp(-0.582+1.235×咳痰+0.885×高血压+0.677×CRUB-65)。纳入Ⅲ组和Ⅳ组患者建立细菌病毒混合感染预测模型,通过单因素logistic回归分析的结果将有统计学意义的因素进行多因素logistic回归分析得出其独立因素建立方程:P(y=1)=exp(-0.796+1.603×免疫抑制治疗0.904×CRUB-65)/1+exp(-0.796+1.603×免疫抑制治疗0.904CRUB-65)。同时使用列线图对上述三个预测方程进行可视化做图。结论:本研究建立CAP病原预测模型,发现通过上述概率预测方程或者列线图有助于预测细菌或病毒感染。有助临床早期诊断细菌或病毒感染,以进行早期针对性治疗。第四部分传统中药鸦胆子油抗肺炎研究目的:鸦胆子油(Brucea j avanica oil,BJO)是一种从鸦胆子(Bruceajavanica)的果仁或种子中提取的传统中药,具有抗肺癌、胃炎和结肠炎等疗效。然而鸦胆子油是否具有抗肺炎作用目前并不清楚。本研究旨在初步探讨鸦胆子油的抗肺炎作用及相关分子机制。方法:利用脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激RAW264.7细胞建立细胞炎症模型。分为4组:对照组、LPS组、不同浓度(5 μmol/L,10 μmol/L)鸦胆子油+LPS共处理组。不同浓度的鸦胆子油预处理细胞2h后,再加入1 μg/mL LPS刺激细胞,用ELISA法检测RAW264.7细胞培养上清液中肺炎相关炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8含量,用real-time PCR法检测RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 的mRNA表达水平,用Western-blot 检测RAW264.7细胞中IκB的磷酸化和NF-κB/p65的磷酸化水平。结果:LPS能刺激RAW264.7细胞表达和分泌肺炎相关炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8;而当用鸦胆子油共同处理RAW264.7细胞时,可以浓度依赖的方式显著抑制LPS对上述炎症因子表达和分泌的诱导作用。进一步的机制研究发现,LPS刺激可显著上调RAW264.7细胞中NF-κB通路关键分子IκB和p65的磷酸化水平,而鸦胆子油共处理RAW264.7细胞能显著削弱LPS对IκB和p65磷酸化水平的上调作用。结论:鸦胆子油通过抑制巨噬细胞的NF-κB通路,进而抑制肺炎相关炎症因子的表达和分泌,从而发挥抗肺炎作用。我们这一研究为鸦胆子油乳作为肺炎辅助治疗药物提供了理论依据。