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第一部分芒柄花黄素促进前列腺癌PC-3细胞的凋亡背景和目的芒柄花黄素(Formononetin,FN),亦称刺芒柄花素,是红三叶草的主要活性成分,在当归、黄芪等传统中草药中亦被发现。芒柄花黄素已被证明具有多种生物活性,包括抗氧化、抗病毒和保护作用,近年来在抗癌药物的研究中得到国内外学者越来越多的关注。前列腺癌是临床常见的恶性肿瘤,是一种雄激素相关疾病。作为可能的植物激素抗前列腺癌药物,芒柄花黄素是否适于临床用药尚处在研究阶段。本研究通过检测不同浓度芒柄花黄素作用后前列腺癌PC-3细胞中lncRNA H19及细胞凋亡途径相关分子Bax和Bcl-2表达水平的改变,进一步探讨了芒柄花黄素的药理学作用。方法1.配制不同浓度(0、20、40、60、80和100μmol/L)的芒柄花黄素溶液,分别作用于前列腺癌PC-3细胞24h和48h,然后用CCK8法测定不同浓度药物作用后各组细胞的吸光度,探究细胞活性随药物剂量和作用时间的变化趋势。2.将不同浓度(0、25、50和100μmol/L)的芒柄花黄素溶液作用于前列腺癌PC-3细胞48h,然后进行Hoechst33258细胞核染色,在荧光显微镜下观察各药物剂量组的细胞核染色情况。3.通过实时荧光定量PCR法检测不同浓度(0、25、50和100μmol/L)芒柄花黄素作用48h后PC-3细胞中lncRNA H19、Bax和Bcl-2 mRNA表达水平的改变;采用Western-blot方法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达水平的改变。结果1.CCK8实验的结果显示,芒柄花黄素可以明显抑制前列腺癌PC-3细胞的活性。经0、20、40、60、80和100μmol/L浓度芒柄花黄素分别作用24h和48h后,随着药物浓度和药物作用时间的增加,PC-3细胞的活性依次下降。2.Hoechst 33258染色法的结果显示,经芒柄花黄素作用48h后,随着药物浓度增加PC-3细胞核出现增强浓染的比例逐渐升高。3.实时荧光定量PCR和Western blot的结果显示,芒柄花黄素可以下调前列腺癌PC-3细胞中lncRNA H19的表达,减少Bcl-2 mRNA和蛋白的表达,上调Bax mRNA和蛋白的表达。结论本实验的结果表明,芒柄花黄素可以呈时间-剂量依赖性抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖,促进其凋亡。这一效应可能通过下调前列腺癌PC-3细胞lncRNAH19的表达和激活细胞线粒体凋亡途径实现。第二部分 人前列腺癌PC-3细胞中H19基因对IGF-1R的表达具有正向调控作用背景和目的lncRNAH19是一种重要的表观遗传因子,对于前列腺癌的恶性进展可能起到促进作用,因此开发出针对H19基因的前列腺癌治疗药物具有潜在的研究价值。本实验第一部分的结果显示,芒柄花黄素可以通过调节lncRNAH19的表达促进前列腺癌PC-3细胞的凋亡,而其上下游的分子调控机制尚未完全明确。在第二部分中,我们对于PC-3细胞中H19基因和IGF-1R基因之间可能存在的调节作用进行了研究,以期进一步探究芒柄花黄素抗前列腺癌PC-3细胞增殖的内在机制。方法构建H19基因过表达与H19基因沉默慢病毒载体,分别感染人前列腺癌PC-3细胞。96h后提取细胞总RNA,通过检测病毒载体标记及lncRNA H19相对表达水平观察病毒感染效果。通过实时荧光定量PCR方法检测IGF-1R mRNA随H19基因的上/下调发生的改变,探究IGF-1R mRNA与lncRNAH19的表达量之间是否存在相关性。结果在PC-3细胞中,敲低H19基因可以使IGF-1R mRNA的表达量降低,而过度表达H19基因则可以引起IGF-1R mRNA的表达量增加。当lncRNA H19的表达量上调至对照组的21.11±2.10倍时,IGF-1R mRNA的表达量上调至对照组的1.24±0.13倍;而当lncRNA H19的表达量减少到对照组的0.37±0.08倍时,IGF-lR mRNA的表达量下调至对照组的0.71±0.03倍,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 在人前列腺癌PC-3细胞中H19基因对于IGF-1R mRNA的表达可能具有一定的调控作用,芒柄花黄素对前列腺癌PC-3细胞的抑制作用可能通过调控H19/IGF-1R通路实现。