甘薯病毒G(SPVG)外壳蛋白基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

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甘薯是我国四大主要粮食作物之一,也是重要的饲料和轻工业原料,在我国分布广泛。未来对粮食日益增长的需求和甘薯自身的产量高、适应性广等特点将使甘薯置身于优越的竞争地位。但由于甘薯病毒病的广泛存在,严重影响了甘薯的产量和品质。对甘薯病毒病的防治,目前尚无特别有效的化学方法,利用茎尖分生组织培养技术培育甘薯脱毒品种是防治甘薯病毒病最有效的方法,而明确侵染甘薯的主要病毒种类,制备特异性抗体,建立高效快速的病毒检测技术是培育脱毒甘薯的关键。甘薯病毒G(Sweet Potato Virus G,SPVG)是侵染甘薯的主要病毒之一,其常常与甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)等其他potyvirus属病毒混合侵染,导致甘薯产量降低、品质变劣和种性退化,对甘薯生产造成严重危害。目前对SPVG的分子生物学还缺乏深入的研究,国内也未见对SPVG的研究报道。本项研究将通过对SPVG外壳蛋白(CP)基因的克隆、序列分析,明确SPVG河南分离物与其他分离物之间的差异;并通过在大肠杆菌中表达CP基因,通过纯化蛋白、免疫家兔制备抗体,建立该病毒的快速检测技术,为进一步的研究奠定基础。 根据已报道的SPVG CP基因的核苷酸序列设计引物,以感染SPVG的巴西牵牛(Ipomoea setosa)叶片总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得SPVG河南分离物(SPVG-HN)CP基因的目的片段。将其克隆到pMD18-T vector上,进行序列测定。序列分析结果表明:SPVG-HN CP基因由1065个核苷酸组成(GenBank登录号为DQ399861),编码355个氨基酸残基。与GenBank中Egypt1(AJ515380)、LSU-1(AY178991)和LSU-3(AY178990)分离物的核苷酸序列相似性为98%左右,与中国广东分离物SPVG-CH(X76944)和SPVG-CH2(Z83314)的相似性分别为98.1%和85.5%。说明SPVG-HN与SPVG-CH关系较近,而与SPVG-CH2关系较远。利用基因工程方法,将SPVG-HN CP基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,成功构建了原核表达载体pETVGCP。SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到了高效表达;以含表达产物的凝胶为抗原,免疫家兔,制备了SPVG外壳蛋白的抗血清。
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