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以荧光蛋白、荧光素酶为代表的报告系统广泛应用于细胞生物学研究和功能性药物筛选,为研究对象的可视化和多维度量化监测提供了有力工具。拆分蛋白报告系统（split-reporter protein system）是基于功能蛋白片段拆分和互补重构发展起来的新技术。相较于完整报告蛋白,拆分报告蛋白具有编码基因更小、便于与目标蛋白融合、应用灵活度高等优点,特别适合插入到基因组小、编码基因重叠程度高、外源基因容量限制小的病原基因组中作为报告基因。但也存在蛋白功能恢复效率较低、应答时间缓慢、灵敏度低等不足,尚待进一步优化。乙型肝炎病毒（HepatitisB virus,HBV）是导致人类肝脏疾病的重要病原体,长期以来缺乏适合高通量筛选的病毒报告系统,导致抗HBV药物的筛选和研究进展缓慢。HBV基因组长约3.2kb,编码基因开放阅读框高度重叠,将完整的报告蛋白编码基因插入其中往往容易导致感染复制等功能缺陷,给乙肝病毒感染报告系统构建带来极大的挑战。此外,HBV感染复制产生的共价闭合环状DNA（cccDNA）是病毒长期持续携带的根源,难以被现有抗HBV药物清除,如何便捷指示细胞内cccDNA的水平也是HBV模型研究领域的难点问题。本研究的主要目的是探索基于优化的拆分蛋白报告系统构建发展可高效指示HBV感染事件和细胞内cccDNA水平并适用于高通量药物筛选的新型HBV细胞模型,为乙肝治疗新药的发展提供新工具。我们认为拆分报告蛋白片段编码基因小,具备应用于HBV报告系统的潜力。在本研究的前期探索中,我们首先尝试了已报道的拆分绿色荧光蛋白split-GFP:GFP1-10/GFP11报告系统用于指示HBV,未获成功。为提高split-GFP报告系统的性能和适用性,本研究对该系统的序列和组成元件进行系统性优化。通过对30种针对GFP的单域抗体的筛选评估,发现9种针对GFP的单域抗体能够替代GFP11,恢复GFP1-10片段的荧光,其中GBP1效果最优,将GBP1和GFP11融合表达作为荧光触发分子,可显著增强荧光信号强度和荧光恢复的速度;通过点突变的方式优化GFP1-10序列获得其变体Mdd26,可进一步提高拆分GFP报告系统的检测灵敏度和信噪比。我们通过系列实验证实,本研究发明的使用特定单域抗体作为分子伴侣的增强型split-GFP报告系统在定位细胞内特定蛋白、报告Ⅰ型单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus Type 1,HSV-1）感染、表征呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）感染介导的细胞融合、筛选促进成肌细胞融合的小分子药物、指示位点特异性蛋白酶切割事件等多种细胞生物学模型中表现出良好的性能。尽管如此,将该系统应用于构建HBV报告系统时仍然存在对病毒干扰大的问题。为解决上述问题,我们进一步探索了拆分荧光素酶LgBiT/HiBiT系统在HBV报告模型中的应用潜力。对比分析拆分荧光蛋白和拆分荧光素酶LgBiT/HiBiT用于报告指示的性能,结果显示拆分荧光素酶LgBiT/HiBiT有更高的信噪比。我们通过将拆分荧光素酶的短片段HiBiT（11 aa）及其不同序列优化片段插入到HBV Core/preCore的不同位置,优化不同的HBV载体改造方式,最终获得可分泌表达HiBiT的复制形HBV载体（C132Hibit）。该载体支持Doxycycline（Dox）调控的HBV复制,将该载体稳定转染到HepG2细胞,上清可获得具有感染力的重组病毒（HBV-C132Hibit）。使用 HBV-C132Hibit 感染稳定表达 hNTCP 的 HepG2 细胞（HepG2-hNTCP-2B1）,可在感染后的细胞上清中检测到HiBiT生物发光信号的升高,且能被针对HBV的中和抗体阻断。在cccDNA报告模型方面,通过将HiBiT序列整合到HBV Core/preCore基因的不同位置,我们成功构建了 Dox调控cccDNA从头合成的HepaRG-Hibit16稳定整合细胞模型和Cre重组酶控制的HepG2-Rccc1稳定整合细胞模型。细胞中cccDNA水平和细胞培养上清中HiBiT定量水平存在显著正相关,表明可通过检测HepaRG-Hibit16和HepG2-Rccc1培养上清中的HiBiT信号指示药物处理后细胞内cccDNA水平的变化。拆分荧光素酶HiBiT检测仅需1步操作,反应5分钟,大大提高了感染系统和cccDNA报告系统用于大规模自动化药物筛选的可行性。使用上述cccDNA报告模型,我们对189种药物进行了筛选,挑选出11种对HiBiT信号有上调或抑制作用的化合物进行验证,在HepG2-hNTCP-2B1感染模型中,观察到对cccDNA水平相应的上调或抑制效果。其中化合物Palovarotene（一种用于治疗进行性骨化性纤维增生症的临床试验药物）能够同时降低两种模型中细胞培养上清的HiBiT水平。进一步验证发现Palovarotene在HBV复制模型HepAD38、感染模型HepG2-hNTCP-2B1、HepaRG-M14A和人原代肝细胞中均能显著降低HBV的抗原表达水平和cccDNA水平,且未观察到明显细胞毒性,具备作为新型抗HBV药物前体并进一步发展的潜力。综上所述,本研究构建了适用于高通量筛选HBV抑制剂的cccDNA报告模型和重组病毒感染模型,实用性和筛选效率优于现有的其他检测方法,并且首次发现Palovarotene这一药物具有抑制HBV感染并降低cccDNA水平的新功能。此外,本研究发展了单域抗体增强的新型拆分荧光蛋白报告系统,检测灵敏度与信噪比显著提升,并基于此构建了多种指示不同细胞生理现象以及指征病毒感染水平的原创报告模型,可服务于相关领域的新药研发,也为其它应用场景提供了可选工具箱。