血脑屏障(BBB)是阻碍中枢神经系统(CNS)药物到达作用靶点发挥治疗效果的主要障碍。以μ-阿片受体(MOR)的内源性配体内吗啡肽(EMs)为代表的阿片肽类药物,虽然结构上仅由四个氨基酸组成,却蕴含着丰富的生物学特性,尤其表现在镇痛活性方面,这与其作用部位中枢μ-阿片受体紧密相关。然而,EMs外周给药难以穿越BBB,从而大大限制了它在临床上的应用。如何促进这类药物穿过BBB进入CNS内部发挥作用仍然是当前神经系统药物研发所需要克服的一大难题。细胞穿膜肽(CPPs)是近年来发展起来的一种非常有效的载体,它可以运载不同类型的治疗分子如小分子化合物、多肽、蛋白质、核酸和肽核酸等穿过各种细胞膜,包括BBB。其中,由抗菌肽Protegrin1(PG-1)衍生而来的SynB3(RRLSYSRRRF)是一种非常高效的穿膜肽,与TAT和penetratin相比具有更好的BBB穿透性。因此,我们的研究以递送EM-1入脑为目的,采用穿膜肽SynB3为靶头分子,旨在保持游离EM-1镇痛活性的同时寻求一种促进EM-1穿透BBB的途径。工作主要分为以下三部分:1.不同连接键对穿膜肽SynB3递送内吗啡肽-1入脑的影响。迄今为止,关于CPPs递送药物跨越BBB的报道大多侧重于两个方面:一是筛选、改造高效跨BBB的运输肽;二是扩展转运活性分子的范围。然而,关于CPPs与多肽药物分子之间的连接方式在跨越BBB中发挥的角色及对运载机制的阐明并没有相关的研究报道。为了比较不同连接子对SynB3连接EM-1跨越BBB的影响。我们选取三种常用的共价键酰胺键、马来酰亚胺键和二硫键,通过化学连接将EM-1连接到SynB3上形成一种衍生多肽结构。通过药效学实验比较了镇痛活性;通过测定衍生多肽在小鼠脑匀浆和血清中的半衰期,研究了体外酶解稳定性;通过活体动物成像和脑组织切片荧光显微观察定性、定量研究了药物的脑摄取情况。对于筛选出的连接子,我们又进一步通过在体和离体实验研究药物可能存在的释放机制。研究结果显示,与游离的EM-1相比较,三种连接方式的衍生多肽均能提高镇痛活性,并且活体动物成像证明三者均不同程度被SynB3递送进入脑组织,荧光显微镜观察药物分布主要集中在小鼠脑皮质区。其中,表现尤为突出的是二硫键,它在外周血液中稳定,但是进入CNS后容易被大脑内的还原酶还原断裂从而释放出游离药物。更适合于像EM-1这样只有保持原有构象并与中枢受体作用才能发挥药效的多肽。2.穿膜肽SynB3修饰纳米金刚石递送内吗啡肽-1入脑的研究。纳米金刚石(NDs)具备生物相容性、良好的分散性、低毒性以及表面容易功能化等特点,因此可以输送不同大小的治疗分子通过不同途径进入细胞。无论是静电吸附还是共价连接,都可能赋予NDs在体内分布研究、靶向运输以及药效学研究的应用价值。为了更进一步促进SynB3介导EM-1跨越BBB,我们分别构建了物理静电吸附和化学共价连接两种SynB3修饰的NDs脑靶向递药系统。结果表明:化学共价键使得EM-1与NDs连接得更紧密,外周血循环损失较少,最大镇痛效应显著。物理吸附因为存在尺寸依赖效应,药物释放包括快释和慢释两个阶段,因此,虽然最大镇痛效应不及化学连接显著,但镇痛作用持续时间更长久。3.外源化合物跨血脑屏障转运模型的建立。血脑屏障通透性是药物设计时的重要评价指标,在新药的早期筛查中是必不可少的环节。预测药物BBB通透性的模型主要分为四大类:动物活体模型、离体脑组织模型、体外血脑屏障模型模型和数学计算模型。我们根据实验室的条件分别建立了在体原位脑灌流模型和平行人工膜渗透模型并评价了模型的BBB完整性。通过实验室合成的小分子化合物进行BBB通透性的检测,评价了两种方法的相关性,为该两种模型进一步的应用提供了研究基础。总之,我们以递送内吗啡肽-1进入中枢神经系统为研究目标,利用穿膜肽SynB3显著的血脑屏障通透性,不仅对比了不同连接子的优劣从而筛选出更高效、更适合的连接子,并在此基础上将穿膜肽策略应用到新型药物递送材料纳米金刚石上,结合纳米金刚石优良的表面特性,构建穿膜肽修饰的功能化纳米金刚石,用于内吗啡肽的运输,为促进阿片肽类药物血脑屏障通透性进行了有益的探索,并尝试建立血脑屏障的体内体外模型,从而为评价多肽类药物BBB通透性提供更多的途径。