中国樱桃(Prunus pseurdocerasus)是蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)李属(Prunus)的落叶乔木果树,因其果实味道鲜美,营养丰富等特点,深受广大消费者的喜爱;又因其果实成熟期早,成为我国重要的经济栽培果树之一。中国樱桃与其它落叶果树一样,都存在典型的自然休眠现象,而花芽的休眠与休眠解除则与开花率、座果率有着复杂而密切的联系,最终影响果实的产量和品质。目前认为足够的低温积累是诱导中国樱桃花芽休眠解除的关键因素之一,低温积累不足则会影响花芽休眠及休眠解除,因此开展低温积累诱导花芽休眠解除分子机制有重要意义。AP2/ERF是一类植物中普遍存在的转录因子,广泛参与植物的生长发育,具有响应低温等功能。本研究从’短柄’樱桃花芽转录组文库(Genbank accession SRX695147)中筛选了具有完整ORF的AP2/ERF类基因,分析了其生物信息学特征;利用实时定量PCR技术(Real-timePCR)分析所有基因在低温诱导花芽休眠解除过程中的表达特性,筛选了一个与休眠解除相关基因的AP2/ERF转录因子,命名为PpcERFI,利用农杆菌介导法将PpcERF1基因转入拟南芥中,研究了该基因对转基因拟南芥生长发育的影响,更进一步克隆并分析了该基因启动子的表达特性。为深入研究拟南芥早花原因,采用RNA-seq技术对转基因即将抽出花茎的拟南芥进行分析。取得以下研究结果:1、筛选得到21个含有完整ORF的Unigene序列被注释为AP2/ERF转录因子。氨基酸的脂肪指数、疏水性、蛋白质二级结构等理化性质和分布,结果表明:KT369533、KT369543、KT369544、KT369549 和 KT369553 的理论等电点(pI)大于 8,为碱性蛋白质;KT369535、KT369536、KT369538 和 KT369551 的 pI<5,为酸性蛋白质;剩余的5<pI<8,为中性蛋白质,说明这些基因可能在不同生理环境中参与不同信号传导。不稳定指数分析结果表明除KT369536、KT369537和KT369557三个氨基酸的不稳定指数分别为35.14,37.39和39.27外,其余的不稳定指数均大于40。氨基酸分子量之间分析表明它们之间存在较大差异,而原子组成、脂肪指数和总平均疏水性等性质差异不大,总平均亲水性均小于0,表明这些蛋白为亲水蛋白。从蛋白质跨膜区预测分布结果看,它们均分布在膜外,有利于下游基因表达的调控;二级结构预测发现除KT369557之外,其余蛋白的无规则卷曲所占比例基本在50%左右,而KT369557中以α-螺旋所占比例最大,达到42.77%。蛋白亚细胞定位预测KT369543虽然在细胞核、线粒体和细胞质中均有分布,但主要分布在细胞质中;KT369538只分布在细胞核和细胞质中,KT369547分布在细胞核、细胞质和细胞骨架上;KT369535与KT369539在细胞核、线粒体、细胞质、过氧化物酶体和细胞骨架上均有分布,表明AP2/ERFs蛋白分布广泛,在细胞中合成,大部分必须借助于核定位信号进入细胞核内发挥调控作用。2、利用qRT-PCR技术分析了 AP2/ERF类转录因子编码基因分别在不同时间低温处理的花芽中的表达模式,发现21个基因中有15个基因受低温诱导表达强烈,其中KT369538(PpcERFl)最早被诱导,在樱桃花芽低温处理96h后上调2.31倍,随后呈现逐步下调表达,推测该基因可能参与低温诱导花芽休眠解除进程。另有3个基因(KT369536,KT369537和KT369549)对低温的响应不明显,有3个基因(KT369543,KT369544和KT369545)对低温几乎没有响应。3、为进一步探究PpcERFI基因的功能,对转基因拟南芥的种子萌发和开花特性进行了研究,研究发现,未经低温处理的超表达和野生型拟南芥分别在培养箱培养36 h,转基因种子的萌发率达到55.94%,而野生型种子的萌发率仅为27.77%,说明PpcERF1对拟南芥种子的萌发具有明显促进作用。进一步观察发现转基因植株在8片可见叶片时就抽出茎,而野生型植株平均要在10片可见叶片方可观察到此现象,说明转基因植株具有早花现象。推测该基因可能促进转基因拟南芥提前开花。为进一步研究PpcERF1基因的表达特性,本研究克隆了该基因启动子序列,分别采用低温和ABA进行处理,利用荧光素酶活性检测实验进行启动子活性分析,发现转入PpcERF1基因启动子是对照的1.72倍,经过低温处理4天后实验组是对照组的14.84倍,而经过ABA处理的实验组是对照组的5.98倍,表明低温和ABA均能诱导该启动子表达,因此推测与休眠有关的因素可能通过该启动子进行进一步调控。根据以上研究结果,我们认为中国樱桃AP2/ERFs转录因子可能参与了花芽休眠解除过程的调控。4、为深入分析超表达植株出现上述促进作用的可能原因,采用RNA-seq技术对转基因植株和对照植株进行转录组测序分析。分别得到约40 M的clean reads,碱基数达到3.6 G,其中映射到转录组文库的总读数25 M左右,所占比例达到62.24%,用来后续实验分析的唯一匹配读数达到25 M,占61.42%,转录组质量较好。从差异基因表达数据中分析获得上调表达基因627个,其中有11个基因上调倍数大于5,有66个基因上调倍数在2-5之间;获得下调表达的基因364个,其中有3个基因的下调倍数小于-5,有40个基因的下调倍数在-2至-5之间。上调表达的基因大多与CYP、JA等相关,其中上调表达最明显的基因是AT3G48520.1,即CYP94B3,已被证实该基因缺失会引起拟南芥晚花。经荧光定量PCR验证与转录组测序结果相同,进一步证明所得数据的准确性。经对拟南芥幼苗期,四叶期和六叶期的几个关键基因定量鉴定,发现超表达植株的各基因表达量均在野生型之上,推测PpcERF1基因可能通过调控CYP、JA类基因表达而发挥促进作用。根据以上结果推测低温通过诱导中国樱桃AP2/ERF类转录因子的表达,而AP2/ERF转录因子与CYPs类基因可能存在潜在的互作关系,进而参与低温诱导中国樱桃花芽的休眠解除调控。