野燕麦乙酰辅酶A羧化酶基因克隆,表达及突变点检测

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野燕麦是一种世界性恶性农田杂草,主要以化学防治为主,由于除草剂大量单一使用,已经产生严重的抗性。为了明确野燕麦对除草剂的抗性及其机理,本文采用整株测定法测定了24个野燕麦种群对精噁唑禾草灵的敏感度以及离体条件下测定其乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)对精噁唑禾草灵的敏感度,并进一步探讨了野燕麦相对抗性种群和敏感种群ACCase基因相对表达量差异以及ACCase氨基酸序列突变点检测。具体结果如下:1、通过整株测定法测定了24个野燕麦种群对精噁唑禾草灵的敏感度。结果表明,就茎而言,对精噁唑禾草灵最不敏感的野燕麦种群是西华(周口),其IC50的值为643.790g.a.i/hm2,襄县(许昌)是最敏感的种群,其IC50值为4.23 g.a.i/hm2,两者相差151.2倍;就根而言,武陟(焦作)是最不敏感的地区,其IC50为2977.041 g.a.i/hm2,鄢陵(许昌)是最敏感的地区,其IC50为793.75 g.a.i/hm2,两者相差2.75倍。虽然根与茎对精噁唑禾草灵的敏感度差异性很大,但均表明,野燕麦对精噁唑禾草灵产生了不同程度的抗性。2、离体条件下测定了24个野燕麦种群ACCase对精噁唑禾草灵的敏感度。结果表明,鹤山(鹤壁)地区的野燕麦种群ACCase对精噁唑禾草灵的敏感度最高,其IC50为11.334 mg/L;社旗(南阳)地区野燕麦种群ACCase对精噁唑禾草灵的敏感度最低,其IC50为17720.677mg/L。综合不同种群野燕麦对精噁唑禾草灵的敏感度来看,对精噁唑禾草灵敏感度低的野燕麦种群,其ACCase对精噁唑禾草灵的敏感度也都较低,反之亦然。这说明野燕麦对精噁唑禾草灵的抗性与ACCase关系密切。3、用IC10(6.9 mg/L)的精噁唑禾草灵处理24小时后,采集样本并构建cDNA文库,然后通过转录组测序(RNA-Seq)筛选出差异表达的ACCase基因,最后利用实时荧光定量PCR对其中相似度最高的ACCase基因进行验证。结果共筛选出8个注释为乙酰辅酶A羧化酶的unigenes,其中有5个下调,3个上调。为了进一步明确ACCase与野燕麦对精噁唑禾草灵抗药性之间的关系。我们用精噁唑禾草灵分别处理社旗(Y21),西华(Y3),召陵(Y24)三个抗性种群和敏感种群鹤山(Y11),24 h后收集样本,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析精噁唑禾草灵对其ACCase基因表达的影响。结果表明,3个抗性种群与一个敏感种群的ACCase基因的相对表达量均受到了精噁唑禾草灵的抑制,但抗性种群受到的抑制程度明显要小于敏感种群。这表明野燕麦对精噁唑禾草灵的抗性与ACCase基因的表达能力有关。将3个抗性种群ACCase基因相对表达量进行比较,我们发现ACCase基因相对表达量由高到低依次为社旗(Y21),西华(Y3),召陵(Y24),与ACCase对精噁唑禾草灵敏感度测定结果一致。4、为了验证野燕麦对精噁唑禾草灵的抗性是否由ACCase基因突变引起。我们将遂平(Y19),社旗(Y21),西华(Y3),召陵(Y24)4个相对抗性种群和鹤山(Y11),温县(Y7),舞阳(Y9),淮阳(Y16)4个相对敏感种群的ACCase基因进行克隆,然后与大穗看麦娘(Alopecurus myosuroides,GeneBank accession No.AJ310767)ACCase全长基因进行多序列比对。结果表明,所测地区野燕麦种群在已报道的ACCase氨基酸序列突变(Ile-1781-Leu,Trp-1999-Cys,Trp-2027-Cys,Ile-2041-Asn,Asp-2078-Gly,Cys-2088-Arg)处均没有发生点突变。这表明我们所测定的野燕种群对精噁唑禾草灵的抗药性不是由所报道的靶标位点突变引起的。
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