目的:血清特异性IgE是诊断食物过敏的重要指标,已发展至分子诊断水平。抗原表位是抗原与抗体结合的基本单位,通过抗原表位解析,实现特异性IgE的精准检测。本研究以Ana o 3作为研究对象,利用冷休克表达系统获得Ana o 3重组抗原;同时,解析Ana o 3抗原表位,并制备关键抗原表位串联重组蛋白,提高特异性IgE精准检测水平。方法:1.腰果Ana o 3的重组表达:提取腰果总RNA,逆转录至cDNA,设计特异性引物,通过巣式PCR技术克隆腰果Ana o 3基因,将其插入pCold-SUMO vector,鉴定并测序;重组质粒测序正确后,转化BL21(DE3)感受态细胞,低温15℃诱导表达。摸索诱导表达条件,以便获取可溶性好、表达量高的Ana o 3重组蛋白,镍柱纯化。利用腰果过敏血清作为识别抗体,通过Western blot鉴定免疫活性。2.关键抗原表位的获取:使用三种预测线性抗原表位的软件(DNAsTAR,ABCpred,Bepipred Liner Epitope Prediction)筛选抗原表位。查阅最新关于Ana o3抗原表位研究的文献,并与软件预测结果对比,最终筛选出12条肽段并人工合成。采用斑点印迹技术,以29例腰果Ana o 3过敏患者血清s IgE作为一抗,筛选出反应率高的线性表位作为关键抗原表位。3.关键抗原表位串联重组体的构建及表达:获取关键抗原表位的碱基序列,中间插入柔性肽Linker碱基序列串联,5’端和3’端分别加入StuⅠ和BamHⅠ碱基序列,人工合成抗原表位串联体基因。接着,将该基因与pCold-SUMO质粒进行重组质粒构建,并测序成功。将该重组质粒转入BL21 DE(3)感受态细胞进行重组表达,摸索最优诱导表达条件,镍柱纯化目的蛋白,并进行免疫学活性鉴定。结果:1.从腰果中成功克隆出了Ana o 3基因,并将该基因与pCold-SUMO质粒连接送去测序。将测序结果进行比对分析,发现克隆获取的腰果Ana o 3基因序列为417 bp,与GenBank上Ana o 3基因CDS序列基本一致,而所编码的138个氨基酸则完全相同;SDS-PAGE结果显示,重组Ana o 3分子量为27 kDa左右,大小与理论预测值基本一致;Western blot结果显示,重组Ana o 3与腰果过敏患者血清具有良好的反应性。2.查阅Ana o 3表位的文献,选取12段有反应的肽段作为候选表位。斑点印迹结果显示,12条候选表位肽段与阳性血清呈现不同程度的反应,而11号肽段几乎无反应。统计各候选表位肽段的反应频率,发现1、2、3、6、10号肽段与Ana o 3过敏血清的反应频率几乎均在80%以上,因此将1、2、3、6、10号抗原表位作为关键抗原表位。3.考虑到1、2、3肽段依次有12个氨基酸相互重叠,因此可将其视为同一表位。SDS-PAGE结果显示,抗原表位串联重组蛋白分子量为22 kDa,与理论预测大小相符。Western blot结果显示,抗原表位串联重组蛋白能和Ana o 3过敏血清s IgE呈现良好的反应性。结论:1.基因克隆并于冷休克原核表达系统获得的Ana o 3重组蛋白,表达量高且免疫活性强,证实了该重组Ana o 3作为已知抗原用于腰果过敏sIgE检测的有效性。2.查阅文献及生物信息学预测获得的12个候选抗原表位,除了11号以外,其余均为腰果Ana o 3的抗原表位,预测结果较准确。3.利用冷休克原核表达系统获得的关键抗原表位串联重组蛋白,具有良好的免疫活性,有可能用作腰果Ana o 3血清sIgE检测的优质原料。