间皮素对卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生长的影响及基因治疗研究

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目的:利用慢病毒介导的RNA干扰(RNA interference RNAi)和cDNA过表达技术,沉默和上调SKOV3细胞株中间皮素(Mesothelin MSLN)基因的表达,创建了稳转细胞株(SKOV3-MSLN-shRNA、SKOV3-MSLN-cDNA)。利用创建的稳转细胞株建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型,观察MSLN对裸鼠成瘤率、移植瘤的数目及重量的影响。应用间皮素RNAi慢病毒液进行治疗,并观察其疗效。同时进行检测慢病毒液的毒性试验。方法:1裸鼠动物模型的建立雌性BALB/c裸小鼠,4-6周龄,体重13.5-16.5g在清洁级(SPF级)环境中,常规收取SKOV3、SKOV3-MSLN-shRNA(SKOV3感染LV-MSLN-shRNA病毒液后稳定表达的细胞株)、SKOV3-MSLN-cDNA(SKOV3感染LV-MSLN-cDNA病毒液后稳定表达的细胞株)、SKOV3-MSLN-neg (SKOV3感染LV-MSLN-neg病毒液后稳定表达的细胞株)细胞(由本课题组自建,并已经过鉴定),制备细胞悬液2.5×107个细胞/ml。抽取0.2ml细胞悬液(5×106个)注射在裸鼠腹腔内。2实验分组2.1荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型的建立(实验一):裸鼠随机分成4组,SKOV3组、SKOV3-MSLN-cDNA组、SKOV3-MSLN-neg组、SKOV3-MSLN-shRNA组,每组5只,四种卵巢癌细胞分别注射到裸鼠腹腔内,14天后观察成瘤情况。2.2单次慢病毒注射荷人卵巢癌裸鼠腹腔成瘤生长状况的观察(实验二) :裸鼠随机分成4组,慢病毒液LV-MSLN-cDNA(间皮素cDNA过表达慢病毒)组、LV-MSLN-neg(间皮素空载体慢病毒)组、LV-MSLN-shRNA(间皮素小干扰慢病毒)组和空白对照PBS组,每组5只,卵巢癌细胞SKOV3分别和PBS及三种慢病毒液同时单次注射到裸鼠腹腔内,14天后观察成瘤情况。2.3多次慢病毒注射荷人卵巢癌裸鼠腹腔成瘤生长状况的观察(实验三):裸鼠随机分成3组,慢病毒液LV-MSLN-neg组、LV-MSLN-shRNA组和空白对照PBS组,每组10只,卵巢癌细胞SKOV3分别和PBS及两种慢病毒液同时裸鼠腹腔内注射,后续隔日注射慢病毒液及PBS,14天后观察成瘤情况。2.4慢病毒毒性实验(实验四):裸鼠随机分成3组,慢病毒液LV-MSLN-neg组、LV-MSLN-shRNA组和空白对照PBS组,每组5只,裸鼠腹腔内分别注射慢病毒液及PBS,3周后处死裸鼠取腹腔各脏器进行病理组织学检查,观察慢病毒对裸鼠腹腔各脏器的毒副作用。3移植瘤生长情况的观察每天观察裸鼠生长情况,用电子天平称重并测量腹围,腹围增加明显者认为腹腔转移瘤或腹水形成,以后每隔2天测量裸鼠体重和腹围。接种14天后处死裸鼠,解剖腹腔,观察腹腔有无转移灶,若有转移灶,记录转移灶个数、部位,测量最大瘤体直径,剥离肿瘤进行称重。4 Western Blotting检测多次慢病毒注射治疗荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤组织中MSLN蛋白的表达。5免疫组织化学法检测多次慢病毒注射治疗荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤组织中MSLN的表达。6肉眼及病理学HE染色检查慢病毒毒性试验中裸鼠各脏器有无改变。结果:1移植瘤生长状况的监测:1.1荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型的建立:亲本细胞SKOV3组、SKOV3-MSLN-cDNA组及SKOV3-MSLN-neg组裸鼠接种第14天体重和腹围较SKOV3-MSLN-shRNA组裸鼠明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。处死裸鼠后解剖发现,SKOV3-MSLN-shRNA组裸鼠与其他三组相比较,成瘤率为60%(3/5),肿瘤个数较少,分布范围较局限,主要集中在注射部位、大网膜和肠系膜,其他部位较少见。1.2单次慢病毒注射荷人卵巢癌裸鼠腹腔成瘤生长状况的观察:慢病毒液LV-MSLN-shRNA治疗组、LV-MSLN-neg治疗组和LV-MSLN-cDNA治疗组与空白对照PBS组裸鼠比较,在接种第14天体重和腹围无明显差别(P>0.05),慢病毒液LV-MSLN-shRNA治疗组的移植瘤成瘤率为100%(5/5),肿瘤的重量、个数、分布与其他两组相比较,没有统计学差别(P>0.05)。1.3多次慢病毒注射荷人卵巢癌裸鼠腹腔成瘤生长状况的观察:慢病毒液LV-MSLN-shRNA治疗组与空载体对照LV-MSLN-neg组和空白对照PBS组比较,裸鼠在接种第14天体重较后两组明显轻(P<0.05),慢病毒液LV-MSLN-shRNA治疗组的移植瘤成瘤率为40%(4/10),肿瘤的重量、个数及分布与其他两组相比较差异具有显著性(P<0.05)。2 Western Blotting结果显示,多次慢病毒注射治疗荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤实验中慢病毒液LV-MSLN-shRNA治疗组、LV-MSLN-neg空载体对照组与空白对照PBS组相比较对MLSN基因的干扰效率分别为75.6%和8.9%,LV-MSLN-shRNA治疗组与其他两组有明显的统计学意义(P<0.05)。3免疫组织化学法检测多次慢病毒注射治疗荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤实验中各组间肿瘤组织MSLN的表达情况: MSLN表达在肿瘤细胞的胞膜上,慢病毒液LV-MSLN-shRNA治疗组MSLN的表达值为3.20±0.33,慢病毒液LV-MSLN-neg治疗组MSLN的表达值为7.42±0.53,PBS对照组MSLN的表达值为7.88±0.29,统计结果显示,慢病毒LV-MSLN-shRNA治疗组和其他两组间有统计学意义(P<0.05),而慢病毒液LV-MSLN-neg治疗组和空白对照PBS组间无明显的统计学意义(P>0.05)。4毒性试验结果:腹腔内分别注射相同剂量慢病毒液LV-MSLN-shRNA及LV-MSLN-neg的裸鼠3周后体重差(1.44±0.34,1.64±0.29)与空白对照PBS组(1.43±0.43)比较,差异无统计学意义(P>0.05),裸鼠一般状况良好,饮食及活动正常,未发现明显的全身毒副作用。21天后处死裸鼠,各器官均未发现明显的肉眼病理改变,取心、肝、脾、肾做病理学HE染色观察,均未见明显病理改变。结论:1卵巢癌细胞SKOV3在腹腔内的种植、转移受到间皮素的影响,间皮素表达降低时,裸鼠腹腔移植瘤的数量及重量相应的减少,一定程度上延缓了卵巢癌的生长和转移。2通过间皮素小干扰慢病毒的基因治疗减少了肿瘤细胞和间皮细胞间皮素的表达,从而对卵巢癌细胞的种植、转移起到了一定的抑制作用,裸鼠动物体内实验证明间皮素基因沉默治疗有效。3慢病毒治疗对实验动物未见明显的毒性,是一种比较安全可靠的治疗方法。
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