第一部分：SD大鼠乳鼠耳蜗器官体外培养技术目的：探讨内耳器官培养技术使毛细胞、螺旋神经元及听神经纤维在体外培养环境维持完整形态,为进一步开展药物的耳毒性及其保护性研究奠定了实验技术的基础。方法：选用Sprague Dawley大鼠2-3天的新生乳鼠,解剖显微镜下解剖分离前庭器官膜、外侧壁、基底膜。将基底膜分成三段,顶、中、底回三个节段,利用培养基的液体表面张力铺放将基底膜和前庭器官等各个器官,平整向上平整铺放在培养皿表面,培养48小时后观察基底膜形态并计数毛细胞数量。结果：前庭毛细胞和耳蜗毛细胞静纤毛整齐排列,无紊乱,前庭毛细胞排列整齐无缺失,基底膜三个节段的三排外毛细胞和一排内毛细胞沿柯替氏器螺旋器(OC, Organ of Corti)整齐排列,无缺失。螺旋神经结细胞排列密集,呈椭圆形,细胞体积大,胞核清晰,听神经纤维排列整齐,无断裂。结论：运用液体表面张力贴壁方法,可以在体外环境下获得观察方便、形态结构完整的的耳蜗器官和组织。第二部分：尼古丁对新生大鼠体外培养基底膜的毒性作用目的：建立尼古丁耳毒性的体外培养损伤模型,探讨尼古丁在耳蜗毛细胞、螺旋神经结细胞和神经纤维及的毒性作用及剂量反应关系。方法：分离培养2-3天SD大鼠耳蜗基底膜,按照不同作用浓度(0-100ng/ml)处理尼古丁24小时。对耳蜗毛细胞和螺旋神经结及听神经纤维丝采用免疫荧光染色进行观测,分别对毛细胞,螺旋神经纤维和神经元计数。对毛细胞、支持细胞及毛细胞静纤毛束的超微结构使用扫描和透射电子显微镜观察。结果：通过对不同尼古丁浓度处理的毛细胞计数,毛细胞损失量随尼古丁浓度的增加。尼古丁的内、外毛细胞受到类似的损伤,毛细胞的损伤,且基底膜底回毛细胞较顶、中损伤严重。尼古丁的处理导致毛细胞胞浆空泡增多,静纤毛束紊乱和缺失,线粒体数量减少、内质网肿胀和脱颗粒改变。螺旋神经元和听神经纤维未受到明显损伤。结论：尼古丁主要损害体外培养毛细胞,尼古丁所造成的毛细胞损伤模式有耳蜗底回扩展到顶、中回,尼古丁耳毒性呈剂量依赖关系,但对螺旋神经元和听神经纤维无明显损伤。第三部分：格尔德霉素衍生物17-DMAG通过上调HSP70对新生大鼠耳蜗尼古丁毒性保护作用目的：研究格尔德霉素衍生物17-DMAG在体外培养的环境下能否保护尼古丁引起的耳蜗毛细胞损伤。方法：分离培养2-3天SD大鼠耳蜗基底膜,筛选出具有培养能够保护毛细胞的17-DMAG处理浓度,基底膜分为空白对照组、单独尼古丁处理组和17-DMAG预处理5小时后尼古丁处理组。运用ELISA和实时定量PCR检测HSP70的蛋白和mRNA表达水平：通过荧光免疫组织化学技术检测HSP70在离体培养基底膜的细胞定位,并对各组内、外毛细胞进行计数。结果：在体外培养基底膜,HSP70主要定位于体外培养基底膜周围部分新生的支持细胞及内、外毛细胞的胞浆内。17-DMAG诱导HSP70的蛋白和mRNA水平的表达上调。经过17-DMAG预处理5小时后尼古丁处理,通过对基底膜内、外毛细胞计数,预处理组毛细胞数量大于单独尼古丁处理组,两者有显著性差异(P<0.001)。17-DMAG能够保护尼古丁对毛细胞的损伤。结论：17-DMAG可通过上调HSP70蛋白及mRNA的表达水平对新生大鼠耳蜗毛细胞尼古丁损伤保护作用。17-DMAG可作为保护尼古丁导致的毛细胞损伤的耳毒性保护剂。第四部分：钙依赖性钾通道BK在C57BL/6J小鼠耳蜗的年龄相关性表达及老年性聋的关系目的：研究C57BL/6J小鼠耳蜗钙依赖性钾通道BK年龄相关性表达,探讨BK通道与老年性聋的关系。方法：将小鼠按照年龄分为4、12、26和52周四个实验组。利用免疫荧光组化技术定位BK通道在各个年龄段的小鼠耳蜗表达部位,荧光实时定量PCR法和免疫印记法检测BK通道在mRNA和蛋白水平的在不同周龄组的表达情况。结果：免疫荧光提示：在各年龄段的小鼠耳蜗内BK主要定位在毛细胞、耳蜗外侧壁和螺旋神经元。实时定量PCR法和免疫印记法提示BK的蛋白及mRNA水平随着年龄增加而逐渐减少。结论：BK通道在各组小鼠耳蜗中的蛋白及mRNA的表达量随年龄增加而降低。年龄相关性BK表达减低与年龄相关性听力减退有关。本实验表明BK的表达减低可能与老年性聋的发病机制相关。