截止到2013年,据相关资料显示,我国癫痫的患病率约7.2‰,据此估计我国约有900万左右的癫痫患者,同时每年新增加癫痫患者约40万(癫痫的诊断和治疗)。癫痫是一个发作性疾病,癫痫的频繁发作造成严重的神经功能障碍,癫痫持续状态可以造成死亡。抗癫痫药物依然是治疗癫痫的最基本治疗方法,近几十年,多种新型抗癫痫药物的出现显著提高了药物的耐受性,仍有约30%的癫痫患者不能通过药物治疗得到控制,给患者及其家庭带来了巨大的负担。因此对癫痫的研究具有非常重要的现实意义。癫痫的发病机制复杂,癫痫持续状态导致神经元死亡及其分子机制仍不十分清楚。近年来对于颞叶癫痫的研究取得了很大进展,颞叶癫痫会导致一个重要的病理变化是海马硬化,表现为神经元脱失和胶质细胞增生。目前主要有以下几个观点:神经元电位异常、离子通道异常、中枢神经系统的神经递质失衡、免疫功能异常、细胞凋亡、基因异常等。一般认为癫痫持续状态可诱导谷氨酸过度释放,激活谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸受体,触发钙离子向神经元内流,激活一氧化氮合酶,产生大量自由基,活化多种与细胞死亡相关的蛋白,最终导致神经元发生程序性死亡。国内外针对癫痫的多项研究表明,癫痫发作具有阶段性进展的特征,在各种致痫因素(颅脑外伤、颅内感染、颅内寄生虫感染、神经退行性疾病等)的作用下,在癫痫发作的早期神经元发生可逆性损伤,可以通过治疗措施挽救受损细胞,而到了癫痫发作的中晚期,癫痫对神经元造成的损害将会进展为不可逆性损伤,应用抗癫痫药物后也只能使少量神经元免于发生坏死。因此,在癫痫发作早期应用药物治疗成为预防及治疗癫痫的新方向。黄芩苷(Baicalin)是中药黄芩(黄芩)中主要的黄酮类化合物之一(分子式:C21H18O11)黄芩苷具有许多不同的药理作用,如抗氧化剂、光保护剂、神经保护剂、抗菌剂、抗肝毒性和抗癌作用。黄芩苷能否在癫痫发作中通过调节自噬对海马神经元发挥保护作用成为了新的探索点。我们的前期研究表明黄芩苷在癫痫发作中发挥着神经保护作用,具体机制尚未阐明。细胞稳态的维持取决于细胞内大分子物质生物合成与代谢的平衡,这一平衡的打破往往导致细胞发生自我调节以适应环境。自噬功能在神经系统疾病中的研究已经取得了大量的突破性研究,自噬与神经退行性疾病、缺血性脑损伤、中枢神经系统感染、免疫异常以及癫痫等多种神经系统疾病的发生密切相关。自噬(autophagy)这个词是来源于希腊语,“auto”(自我)和“phagy”(吞噬)的结合,即细胞的自我消化过程。到目前为止,自噬是否参与癫痫发作诱发的氧化应激反应,以及在神经元死亡中发挥何种作用;中药黄芩苷对癫痫发作的保护机制与自噬的关系仍未见报道。本研究建立LiCl-PILO(pilocarpine,PILO)诱导的大鼠癫痫模型,探讨癫痫发作后海马神经元损伤后的自噬现象的病理特征:分别应用中药黄芩苷和自噬抑制剂3-甲基嘌呤(3-MA)进行干预,检测与自噬相关的蛋白和信号分子的变化,探讨自噬在大鼠癫痫致海马损伤中的作用及其分子机制。本研究分三部分。第一部分锂-匹罗卡品诱导的大鼠颞叶急性癫痫模型的海马神经元损伤观察及自噬的变化规律目的:探讨PILO诱导大鼠癫痫模型海马神经元损伤的病理特征;研究自噬在致痫大鼠海马组织中的变化规律。方法:Wistar大鼠为研究对象,50只成年雄性并且健康的wistar大鼠随机分为5组:对照组、癫痫发作3h组、癫痫发作6h组、癫痫发作12h组、癫痫发作24h组。模型成功后分别于相应时间后,行脑切片(每组5只)Tunel荧光染色、HE染色及Nissl染色以及取组织标本(每组5只)做western blot检测自噬相关蛋白P62/SQSTM1、LC3、Beclin1的表达,观察单纯锂-匹罗卡品致癫痫大鼠海马神经元的损伤情况及海马组织自噬相关蛋白的表达。结果:1.注射匹罗卡品(PILO)后2-20min出现刻板行为:表现为血泪、眨眼、动须、节奏性咀嚼或探索行为、反复头颈上仰,随后出现面肌阵挛、点头、单侧或双侧前肢阵挛、伴直立、跌倒或翻转,最后可发展至全身强直痉挛持续状态发作。实验组组40只大鼠,皆出现III-V级发作,并最终呈SE(其中存活38只,死亡2只)。待大鼠出现SE发作后2h,以地西泮终止,减少癫痫活动。2.组织形态学结果(HE、Nissl染色):HE染色结果:对照组大鼠海马CA1、CA3区神经元形态正常,细胞结构完整清晰,排列整齐紧密,胞核呈圆形或椭圆形,胞浆透明,染色质均匀分布,核仁清晰。模型组(3h,6h,12h,24h)海马CA1、CA3区神经元形态不完整,排列紊乱,细胞肿胀,破裂,细胞间距加大,轮廓模糊,界限不清,存在大量变性、坏死神经元胞体,细胞核浓缩,核固缩,核仁不清晰,失去正常结构,以24h post-SE最为明显。Nissl染色结果:对照组大鼠海马CA1区椎体细胞结构清晰完整,细胞核结构正常,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富。模型组(3h,6h,12h,24h)海马CA1、CA3区组织形态学可见神经元肿胀、排列紊乱,膜破裂,胞浆尼氏小体减少,且随着时间延长神经元死亡越明显,24h最为明显。3.TUNEL荧光:对照组大鼠海马染色未见TUNEL阳性细胞,模型组(3h,6h,12h,24h)海马TUNEL阳性细胞数均有表达,并随着癫痫发作时间延长阳性细胞增多,以24h最为明显。4.Western blot结果:大鼠致痫后3h,6h,12h,24h海马组织LC3II/LC3I的比值及Beclin1表达降低(n=5,P<0.05),p62/SQSTM1的表达增加(n=5,P<0.05)。结论:与对照组相比,锂-匹罗卡品癫痫大鼠海马神经元数目减少、受损明显,受损神经元存在自噬受到抑制的现象。第二部分不同剂量黄芩苷对氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫持续状态大鼠行为学影响及其机制的研究目的:研究不同剂量黄芩苷对大鼠癫痫持续状态的行为学影响及其作用机制。方法:50只Wistar大鼠被随机分为5组:癫痫发作组(24h post-SE),n=10;黄芩苷干预组4组(50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg),每组n=10。腹腔注射匹罗卡品后,将大鼠放于40cm×80cm的鼠笼里密切观察动物行为2h并做好实验记录。模型成功后分别于相应时间后,行脑切片(每组5只)Tunel染色、HE染色及Nissl染色以及取组织标本(每组5只)做western blot检测自噬相关蛋白P62/SQSTM1、LC3、Beclin1的表达,观察不同剂量黄芩苷对锂-匹罗卡品致痫大鼠海马神经元的损伤情况及海马组织自噬相关蛋白的表达。结果:1.潜伏期(出现Racine IV级以上的癫痫发作时间):癫痫模型组29.60±6.603,黄芩苷(50mg/kg)干预组41.20±11.84,黄芩苷(100mg/kg)干预组41.70±10.93,黄芩苷(150mg/kg)干预组45.70±9.190,黄芩苷(200mg/kg)干预组63.80±11.73;和癫痫模型组(24h post-SE)相比,黄芩苷干预组潜伏期明显延长,且差异有统计学意义(P<0.01);黄芩苷(50,100,150,200mg/kg)干预组组间无统计学差异,但200mg/kg干预组其癫痫发作潜伏期有显著延长趋势。2.组织形态学结果:模型组(24h post-SE)海马CA1、CA3区神经元形态不完整,排列紊乱,细胞肿胀,破裂,细胞间距加大,轮廓模糊,界限不清,存在大量变性、坏死神经元胞体,细胞核浓缩,核固缩,核仁不清晰,失去正常结构。黄芩苷干预组海马神经元损伤程度均有不同程度的减轻。Nissl染色结果:模型组(24h post-SE)海马CA1、CA3区组织形态学可见神经元肿胀、排列紊乱,膜破裂,胞浆尼氏小体减少,黄芩苷干预组海马神经元损伤程度均有不同程度的减轻。3.TUNEL荧光:模型组(24h post-SE)海马TUNEL阳性细胞数有表达,黄芩苷干预组海马TUNEL阳性神经元数量均有不同程度的减少。4.Western blot结果发现,不同浓度黄芩苷(50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg)干预组海马组织LC3II/LC3I的比值及Beclin1的表达较PILO致痫模型(24h post-SE)组显著增加(n=5,P<0.05),p62/SQSTM1的表达显著降低(n=5,P<0.05)。5.免疫荧光结果,单标染色P62/SQSTM1在不同浓度组(50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg)干预的组织中表达有不同程度的降低,单标染色Beclin1的表达均有不同程度的升高。结论:结果显示,早期应用黄芩苷在癫痫发作具有保护海马神经元的作用;黄芩苷可能通过上调受损神经元自噬活性发挥神经保护作用。第三部分:通过PI3-K/Akt/mTOR信号通路上调海马神经元自噬活性可能是黄芩苷减轻癫痫发作脑损伤的机制之一目的:探讨大鼠癫痫持续状态(24h post-SE)及应用黄芩苷预处理(200mg/kg)后海马神经元自噬的表达水平;并进一步探讨黄芩苷预处理是否通过PI3-K/Akt/mTOR通路上调海马自噬活性,从而减轻癫痫所致海马神经元损伤。方法:20只大鼠被分为4组:对照组、24h post-SE、24h post-SE+Baicalin、24h post-SE+Baicalin+3-MA(给予侧脑室注射3-甲基嘌呤-选择性自噬抑制剂)模型成功后分别于相应时间后,行脑切片(每组5只)Tunel染色、HE染色及Nissl染色以及取组织标本(每组5只)做western blot检测自噬相关蛋白P62、LC3、Beclin1,凋亡蛋白Bcl2、Bax、cleaved-caspase3及通路蛋白PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、ULK1、p-ULK1的表达。结果:1.组织形态学结果:对照组(Control)大鼠海马CA1、CA3区神经元形态正常,细胞结构完整清晰,排列整齐紧密,胞核呈圆形或椭圆形,胞浆透明,染色质均匀分布,核仁清晰。模型组(24h post-SE)海马CA1、CA3区神经元形态不完整,排列紊乱,细胞肿胀,破裂,细胞间距加大,轮廓模糊,界限不清,存在大量变性、坏死神经元胞体,细胞核浓缩,核固缩,核仁不清晰,失去正常结构。黄芩苷干预组(SE+B)海马神经元损伤程度均有不同程度的减轻。3-MA干预组(SE+B+3-MA)较黄芩苷干预组相比,海马CA1、CA3区形态异常神经元数量增多,细胞肿胀加重,甚至破裂,细胞间距加大,轮廓模糊,界限不清,变性、坏死神经元胞体增多,细胞核浓缩,核固缩,核仁不清晰,失去正常结构。Nissl染色结果:对照组大鼠海马CA1区椎体细胞结构清晰完整,细胞核结构正常,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富。模型组(24h post-SE)海马CA1、CA3区组织形态学可见神经元肿胀、排列紊乱,膜破裂,胞浆尼氏小体减少。黄芩苷干预组海马神经元损伤程度均有不同程度的减轻。3-MA干预组(SE+B+3-MA)较黄芩苷干预组相比,海马CA1、CA3区神经元肿胀加重,甚至破裂,排列紊乱,胞浆尼氏小体减少。2.TUNEL荧光:对照组大鼠海马CA1区染色未见TUNEL阳性细胞。模型组(24h post-SE)海马TUNEL阳性细胞数有表达。黄芩苷干预组海马神经元凋亡数量明显减少。3-MA干预组(SE+B+3-MA)较黄芩苷干预组相比,海马TUNEL阳性神经元数量明显增加。3.Western blot:与模型组(24h post-SE)相比,3-MA干预(SE+B+3-MA)组中LC3 II和Beclin 1的显著降低,P62的蛋白质水平增加。与对照组(Control)相比,模型组(SE)组大鼠神经元中Bax、cleaved-caspase3的水平增高,Bcl-2的蛋白水平明显降低。黄芩苷干预后Bax、cleaved-caspase3蛋白水平明显降低,同时Bcl-2蛋白的表达量明显增高。3-MA干预组(SE+B+3MA)显着增强Bax上及降低Bcl-2。与对照组相比,模型组p-AKT、p-mTOR、p-ULK1表达显著增加,黄芩苷干预组其表达显著降低,3-MA干预组p-AKT、p-mTOR、p-ULK1的表达增加。结论:癫痫持续状态导致海马神经元自噬活性的降低、神经元的坏死及凋亡;黄芩苷预处理通过PI3-K/Akt/mTOR信号通路上调海马自噬活性,这可能是黄芩苷预处理减轻癫痫所致海马损伤的机制之一。