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Wnt信号途径是多细胞真核生物中高度保守的信号途径,其在生物体的生长发育过程中发挥至关重要的作用。在人体中Wnt信号途径的功能失调会诱发包括肿瘤在内的多种疾病。对Wnt信号途径中的新分子和新调节机制的探索将有助于在分子水平阐述Wnt信号途径的多方面功能和其引发的疾病的发病机理。本论文工作针对Wnt信号途径开展机理研究,具体包括以下两个方面的内容。
论文的第一部分工作揭示了一个功能未知基因Zbed3(Zinc finger BEDdomain-containing3)在Wnt信号途径中的新功能及其作用机制。以前的研究工作已经表明,Axin作为脚手架蛋白质组装细胞内的β-catenin降解复合物,抑制Wnt信号的发生；当Wnt信号激活后,受体LRP5/6通过直接结合Axin而抑制β-catenin降解复合物的功能,进而引起细胞内β-catenin的积累,导致Wnt信号途径下游的转录激活。由于Axin在经典Wnt信号途径中的重要地位,我们将Axin作为研究Wnt信号途径在降解复合物水平的靶点。以Axin为诱饵蛋白质进行酵母双杂交筛选,鉴定到Zbed3是其中一个可能的Axin相互作用蛋白质。首先通过体外结合实验和内源蛋白质相互作用分析,我们证明了Zbed3和Axin之间的确存在相互作用。进一步应用酵母双杂交系统验证了Axin与Zbed3相互作用的区段,发现结合活性高的区段和与LRP5/6相互作用的区段相同。而且,与先前发现GSK3β能够促进Axin与LRP5的结合的现象相同,我们的结果表明,GSK3β也能够加强Axin和Zbed3的结合。通过序列分析,我们发现在Zbed3分子内部包含有一个PPPPSFT序列,它与LRP5/6中的PPPPS/TPXT/S高度同源。过去的研究已经证明,LRP5/6通过PPPPS/TPXT/S序列与Axin相互作用,序列中的Ser和Thr的磷酸化能够加强相互作用的亲和力。我们的实验中发现,Zbed3与Axin的相互作用也主要通过PPPPSFT序列介导,而且Zbed3和Axin的相互作用调节机制也与LRP5/6相同。突变Zbed3的PPPPSPT序列中的Ser和Thr为Ala导致Zbed3与Axin二者的相互作用减弱,而且上述SA和TA突变体不再被GSK3β和CKI调节。进一步的研究发现,Zbed3在细胞内过表达可以导致Wnt信号报告基因的表达增强,并诱导细胞内β-catenin的积累；用RNAi的方法抑制细胞内源的Zbed3表达会减弱Wnt信号稳定β-catenin和激活报告基因的作用,也抑制Wnt诱导的下游基因c-myc和axin2的表达。最后,我们发现Zbed3通过结合Axin而抑制降解复合物中GSK3β对β-catenin的磷酸化,从而解释了Zbed3作为Axin结合蛋白质在经典Wnt信号途径中的激活因子功能。
论文的第二部分工作揭示了TAB2(TAK1 Binding protein2)介导TAK1和NLK抑制Wnt信号途径的分子机制。经典Wnt信号通过促成β-catenin和LEF1/TCFs构成的转录复合物而激活下游基因的转录而发挥生物学功能。TAK1-NLK是进化中保守的激酶途径,NLK被激活后通过磷酸化LEF1/TCF家族转录因子而抑制Wnt信号途径引起的基因转录。我们以TAB2为诱饵蛋白质进行了酵母双杂交的筛选,发现NLK和TAB2可能具有相互作用。通过体外结合和免疫共沉淀试验,我们首先证明了TAB2与NLK之间可以直接相互作用。通过分析和寻找TAB2结合NLK的区域,发现TAB2可以通过其不同区域分别结合NLK和TAK1。TAK1和NLK虽为上下游关系,但是不存在直接的相互作用,但TAB2与TAK1和NLK共表达则会诱导三者形成复合物。免疫沉淀细胞内源水平的NLK,我们发现内源的TAK1,TAB2和NLK也会构成蛋白质复合物,而RNA干扰TAB2会导致复合物的解离,表明TAB2在TAK-1-TAB2-NLK复合物中充当脚手架或接头蛋白质作用,暗示TAB2可能会在TAK1-NLK途径中发挥功能。进一步,我们发现TAB2通过结合TAK1和NLK来抑制经典Wnt信号。过量表达TAB2会抑制Wnt信号激活的TOPFLASH活性,而且TAB2的这种抑制作用是发生在Wnt信号的转录复合物水平。NLK的RNAi和TAK1-KD/NLK-KD(Kinase Dead,KD)突变都能解除TAB2的抑制作用,这说明TAB2对Wnt信号的抑制依赖于TAK1和NLK的功能；而TAB2缺失了与NLK的结合区域就减弱了对Wnt信号途径的抑制,说明TAB2在抑制Wnt信号传递的功能中需要与NLK的结合。我们的结果还显示,单独的TAK1几乎不激活NLK的激酶活性,然而在TAB2加入后可以明显促进NLK活化。不仅如此,TAB2还能通过活化TAK1-NLK途径而促进NLK下游底物LE目的磷酸化,以及后续的泛素化；相反,缺失了与NLK的结合区域的TAB2就不具备这些功能。最后,我们证明Wnt信号可能会调节TAK1-TAB2-NLK复合物的形成来负反馈调节自身信号激活的强度。
综上所述,我们从研究经典Wnt信号途径中的新分子和新调节机制的角度出发,阐述了新分子Zbed3与Axin相互作用调节β-catenin降解复合物的功能以及TAB2在TAK1-NLK途径中抑制β-catenin和LEF1/TCFs转录复合物的具体机制。这两个具体工作进一步地加深了我们对经典Wnt信号途径的分子机制的认识。