论文部分内容阅读
肝脏是人体最重要的器官之一,在代谢和免疫方面发挥着重要作用。肝脏通过肝门静脉接受来自肠道的静脉血,致使肝脏持续的暴露在病原体、毒素和食物抗原的环境下。在病理状态下,各种肝脏疾病往往伴随着肝脏炎症的发生,如脂肪肝和肝细胞癌。部分肝细胞癌患者肿瘤组织中DEPTOR的表达比邻近组织的高,尤其是伴随有B型肝炎或预后差的患者。DEPTOR是2009年新发现的一个mTOR抑制因子,参与细胞存活、增殖、成脂分化和自噬等多方面的调控。有研究报道DEPTOR与血管内皮细胞的激活及小鼠骨骼肌代谢性炎症相关。然而,DEPTOR是否参与肝脏炎症目前并未报道。因此,研究DEPTOR是否参与肝脏炎症及其表达调控与作用,不仅有助于了解机体的正常生理调控,也有助于揭示炎症相关疾病发生发展的分子机制并为治疗提供理论依据。本研究利用C57BL/6雌性小鼠、Hepa1-6细胞和HEK293T细胞,通过小鼠腹腔注射LPS构建炎症模型、细胞转染、实时定量PCR、免疫印迹、染色体免疫共沉淀、双荧光素酶报告系统、位点突变载体构建、ELISA、MitoTracker Green FM线粒体染色等方法,对DEPTOR在肝脏炎症中的表达调控及其作用进行了一系列研究,获得如下研究结果:1.构建了LPS诱导的小鼠炎症模型。与对照组相比,LPS诱导的小鼠肝脏组织和脂肪组织DEPTOR mRNA表达显著性下降,肌肉组织DEPTOR mRNA呈下降趋势但因个体差异较大下降未达到显著性水平。LPS诱导的小鼠肝脏组织DEPTOR蛋白降低,而mTORC1/2信号通路活性明显增加。2.在体外,利用小鼠肝细胞系(Hepa1-6细胞)验证了LPS能够下调DEPTOR的表达。3.LPS诱导的小鼠肝脏组织和Hepa1-6细胞中p65的表达上调。Hepa1-6细胞超表达p65下调DEPTOR mRNA和蛋白表达,且p65与LPS呈叠加效应下调DEPTOR蛋白表达。NF-κB抑制物IκBα和PDTC能够显著性削弱LPS对DEPTOR mRNA的下调。因此,LPS通过p65下调DEPTOR的表达。4.启动子转录因子结合位点预测到DEPTOR启动子区含有NF-κB结合位点。染色体免疫共沉淀分析、双荧光素酶报告系统和位点突变载体构建实验证实p65能够与DEPTOR启动子-145/-127区域结合,并下调DEPTOR启动子活性。5.Hepa1-6细胞超表达或者敲减DEPTOR促进巨噬细胞趋化因子MCP-1的表达。6.Hepa1-6细胞超表达DEPTOR促进细胞糖吸收、糖原积累和下调细胞线粒体数目。综上,LPS通过p65信号途径抑制DEPTOR的表达,而超表达DEPTOR则促进炎症因子MCP-1的表达。此外,DEPTOR还能够促进肝细胞糖吸收、糖原积累和下调肝细胞线粒体数目。