沼气发酵工艺已在全世界被广泛应用于解决环境、农业和能源问题,产生了巨大的生态、社会和经济效益。中国是沼气应用规模最大的国家,特别是小型户用沼气池在农村得到广泛推广。沼气发酵过程需要经历水解、酸化、产氢产乙酸和产甲烷4个生化过程,其中发挥关键作用的是一系列原核生物,包括水解酸化细菌、产氢产乙酸细菌和产甲烷古菌。这些生物大多数属于未培养菌,采用纯培养法研究其在发酵过程中的作用还不可行;而采用免培养的分子生态学手段特别是基于16S r RNA基因分析的一系列方法研究沼气发酵微生物类群的组成、结构和动态已被广泛应用。目前,对户用沼气池微生物群落组成、结构和演替及其与产气之间关系等生态学问题的研究报道很少,因此,研究户用沼气池的原核生物群落的相关生态学问题具有重要的理论和应用价值。为此,本研究从云南亚热带地区的农村户用沼气池中采集了污泥以及农户家的畜禽粪便,在实验室采用批量式工艺模拟该气候区域的户用沼气池发酵过程。应用软件SPSS将16S rRNA基因扩增子的DGGE和Illumina高通量测序结果与环境因子相结合,深入分析了批式发酵过程中该区域户用沼气池中的原核生物群落结构、功能,以及它们与环境因子间的相关性,并尝试将群落结构与代谢路径相关联,结果如下。在15℃批量式发酵条件下,细菌和古菌类群结构都不断变化,前24 d变化很大,32–56 d之比较稳定,64 d后变化较大;多数优势类群始终保持优势,且在产气高峰期时优势菌群的丰度进一步提高。在门水平上,细菌主要类群是厚壁菌门(Firmicutes),其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria);古菌的优势菌群是广古菌门(Euryarchaeota),其次是泉古菌门(Crenarchaeota)。在种水平上,平均丰度前10位的细菌类群为:OTU1(与Clostridium sartagoforme相似度97%),OTU209(与Clostridium sartagoforme相似度98%),OTU2(与Terrisporobacter glycolicus相似度99%),OTU4(与Clostridium butyricum相似度100%),OTU3(与Alkaliflexus imshenetskii相似度93%),OTU5(与Advenella mimigardefordensis相似度97%),OTU200(与Sphingomonas sp.相似度100%),OTU366(与Clostridium beijerinckii相似度98%),OTU6(与Turicibacter sanguinis相似度99%),OTU8(与Clostridium sp.Ade.TY相似度为99%)。平均丰度前5位的古菌优势菌群是OTU1(与Staphylothermus hellenicus相似度:82%),OTU7(与Methanobacterium formicicum相似度96%),OTU3(与Methanobacterium formicicum相似度96%),OTU5(与Staphylothermus hellenicus相似度82%),OTU2(与Methanosaeta concilii相似度100%)。不同温度(9–55℃)的批量式发酵结果表明,随着温度的升高,微生物群落结构发生了明显的变化,多数主要优势类群丰度减少,少数升高。在9–35℃期间,多数优势类群的优势地位基本不变;45℃时,与9–35℃的相比,明显不同;55℃时,与9–35℃、45℃的相比,显著改变。门水平上的优势菌群与15℃批量式发酵的相似。种水平上,平均丰度前10位的细菌为:otu1(与clostridiumsartagoforme相似度97%)、otu2(与terrisporobacterglycolicus相似度:99%)、otu5(与candidatuscloacamonasacidaminovorans相似度90%)、otu620(与bifermentans相似度98%)、otu3(与zhouiaamylolytica相似度86%)、otu9(与clostridiumsticklandii相似度90%),otu6(与clostridiumbutyricum相似度100%)、otu450(与galbibactermarinus相似度86%)。古菌的优势类群:otu1(与methanocorpusculumlabreanum相似度99%)、otu6(与methanosarcinathermophila相似度100%)、otu2(与staphylothermushellenicus相似度82%)、otu3(与methanosaetaconcilii相似度100%)(与methanobrevibacter.sp.相似度84%)。15–35℃期间的微生物群落结构和代谢路径很相似,因此,自然条件下的温度变化(15–25℃)对云南亚热带户用沼气池原核生物群落结构的影响很小;当温度从15℃降到9℃时,代谢路径出现了一定差异(主要体现为:9℃时几乎所有甲烷来源于氢还原二氧化碳途径;而15–35℃的甲烷来源以氢还原二氧化碳途径为主,乙酸氧化途径为辅);当温度从35℃升高到45℃时,代谢路径出现一定差异(主要体现为:与35℃的相比,水解细菌、产氢产乙酸菌和产甲烷菌种类有所增加);当温度从45℃升高到55℃时,代谢路径差异显著(主要体现为:与15–45℃相比,水解细菌种类有所增加,发酵产酸菌的种类减少,产乙酸菌不同,产甲烷菌不同(以乙酸氧化途径为主、氢还原二氧化碳为辅))。基于上述分析可以得出:15–35℃期间的沼气发酵微生物类群和代谢路径相似;45℃是发酵微生物群落结构和代谢路径从中温向高温转变的转折点;9℃是微生物群落和代谢路径与15–35℃期间的有所不同。总体而言,批量式工艺中,⑴重复间的原核生物群落的演替和非生物因子的变化是基本同步的;初始原核生物群落与发酵过程中的存在显著不同;相同温度条件下,发酵过程中微生物群落始终在变化;不同温度条件下,各温度发酵的产气高峰期发挥关键作用的优势类群会明显不同甚至根本不同。⑵基于16srrna基因高通量测序的otu及其功能分析,可以较好的将群落结构与代谢路径关联起来。据此得出:对于粪便等富含木质纤维素类原料的沼气发酵,虽然微生物种类非常丰富(超过400个种水平的类群),但发挥关键作用的是极少数优势类群(不超过20种),且这些关键类群多数与可培养菌非常相似。⑶优势细菌类群中丰度最大的一般属于纤维素、半纤维素水解菌,产氢产乙酸菌种类少、丰度较低。少数优势细菌和古菌之间形成了较稳定组合,在发酵中发挥关键或主导作用,不同发酵时期和温度的组合会有所不同甚至明显不同。⑷细菌和古菌中的个别优势类群与沼气生产速率之间存在极显著或显著的正相关性,具有作为发酵好坏标示物的潜力。