超低温冷冻保存精子为长期保存遗传资源提供了可能,但超低温冷冻会影响精子的生理和形态。冻融过程温度和渗透压的改变会改变精子的质膜流动性、质膜通透性、脂质组成以及线粒体活性,也会造成蛋白质的缺失、表达量和功能的改变。本研究以绵羊冻精为实验材料,对不同的精子蛋白制备方法和二维电泳不同上样量进行了探索,建立了绵羊精子蛋白质组学研究技术平台。同时以绵羊鲜精和同一批次自制的冻精为实验材料,利用二维电泳技术建立了绵羊精子冻融前后蛋白质表达图谱。采用PDQuest8.0软件对凝胶图谱蛋白质进行分析,并检测差异表达蛋白质。结果显示:(1)利用一维SDS-PAGE电泳比较三种绵羊精子蛋白质制备方法,热的Trizol法更适合绵羊精子蛋白质制备。(2)采用17cm (pH4～7) IPG预制胶条,考马斯亮蓝染色后合适的上样量为0.45mg。(3)在冻鲜精凝胶上共检测到14个差异表达蛋白质斑点,在冻融精子凝胶上表达上调的有5个,表达下调的有3个,新表达的2个,缺失的有4个。差异蛋白质斑点经液相色谱串联离子阱质谱(LC-MS/MS)鉴定,在国际生物信息学中心数据库搜索到相对应的5种蛋白质:推定的热休克蛋白70.1、转录因子AP-2α蛋白、烯醇酶、烯醇酶1和血清白蛋白前体。在冻融精子中,推定的热休克蛋白70.1、烯醇酶和烯醇酶1表达下调,转录因子AP-2α蛋白表达上调,血清白蛋白前体来自精浆。推定的热休克蛋白70.1需要通过多级质谱与热休克蛋白70.1进行序列同源比对和功能预测,烯醇酶和烯醇酶1与精子活力有关,转录因子AP-2α蛋白能结合在精子DNA特殊序列并激活基因转录,在冷冻过程中,血清白蛋白前体能够与精子表面结合从而保护精子。研究表明:绵羊精子经超低温冷冻后蛋白质的表达存在差异,对差异表达蛋白质的研究有利于探索绵羊精子在冷冻过程中的生理状态,为进一步研究绵羊精子蛋白质组学、寻找冻伤的生物学标志及揭示精子冻伤机理奠定基础。