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2008年中国婴幼儿因食用非法掺杂三聚氰胺(melamine, MA)的配方奶粉爆发尿结石,该事件引起了世人对三聚氰胺或与其同系物三聚氰酸(cyanuric acid, CA)协同作用CMA+CA, MC)对人和动物健康影响的广泛关注。过去大量的研究都集中在MA及其同系物对泌尿系统的毒性作用上,对其他系统的毒性作用研究报道还很少见。本研究采用组织细胞病理学和超微病理学观察技术、免疫组化、Western Blot技术、细胞培养和流式细胞术等方法,在原有研究的基础上,以血睾屏障和支持细胞为切入点,从毒理病理学角度观察研究了MA及其同系物对小鼠生殖系统的毒性作用,在整体水平、组织学水平、细胞学水平、超微水平和分子水平上多角度、系统地揭示了MA对小鼠生殖系统的毒性作用及其机理。研究结果如下：1.体内试验以8周龄雄性昆明小鼠为试验对象,设立对照组,MA组和MC组,其中MA组和MC组分别设立低、中、高三个剂量组,MA剂量分别是30、140和7OOmg/kg.bw/d, MC剂量分别是15(15MA+15CA).70(70MA+70CA)和350(350MA+350CA) mg/kg.bw/d, MC由相同剂量的MA和CA混合。采用灌胃的方式染毒,连续3天,染毒后第1天(Post1d)和第5天(Post5d)剖检取材,评价MA和MC的雄性生殖毒性效应,观察血睾屏障结构的变化,探讨它们对睾丸毒性作用的靶细胞。通过临床观察、血清学分析、剖检及组织病理学观察和精子指标检测可见,Post1d时,与对照组相比,MC各剂量组体重增长均显著下降(P<0.05或P<0.01),中、高剂量组小鼠出现明显的临床症状;高剂量组睾酮水平显著下降(P<0.01),睾丸和附睾脏器指数显著下降(P<0.05或P<0.01)。所有MA和MC组小鼠的睾丸和附睾组织出现了明显的病理学损伤,呈现剂量相关性,病变主要表现为生精细胞脱落和生精小管上皮空泡化,附睾输出管中充满多量脱落的生精上皮细胞,严重者出现少精或无精；所有处理组精子畸形率均显著升高(P<0.05或P<0.01)。到Post5d时,所有处理组精子畸形率仍然是显著升高(P<0.05或P<0.01),其它检测指标显示睾丸毒性程度减轻。以上结果表明,MA和MC对睾丸生精上皮具有直接的损伤作用,从而导致精子质量下降。利用TUNEL染色观察睾丸细胞凋亡情况,并用免疫组化和Western Blot定位和定量检测了Fas/Fas-L蛋白在睾丸组织中的表达变化。结果可见：Postld时,与对照组相比,处理组睾丸生精细胞出现明显凋亡,MA低剂量组和MC各剂量组睾丸凋亡指数显著升高(P<0.05或P<0.01),Fas和Fas-L分别在生精细胞和支持细胞中有不同程度的表达；Post5d时,与对照组相比,MA高剂量组和MC中、高剂量组凋亡指数仍显著升高(P<0.05或P<0.01),MA与MC高剂量组Fas和Fas-L均在生精细胞中出现强阳性表达。上述结果提示,MA和MC可以促进小鼠睾丸的生精细胞凋亡。利用透射电镜观察血睾屏障超微结构变化,并用免疫组化和Western Blot定位和定量检测了各层血睾屏障结构中关键蛋白的表达变化。结果发现：Postld时,与对照组相比,所有MA与MC组的小鼠血睾屏障各层超微结构出现了明显的损伤,主要表现有：毛细血管内皮细胞、肌样细胞和支持细胞胞浆中出现大量空泡,支持细胞间的紧密连接出现明显裂隙；支持细胞中的波形蛋白出现崩解,表达量明显下降(P<0.05或P<0.01),睾丸组织中β-actin蛋白表达量不同程度出现显著下降(P<0.05或P<0.01)。Post5d,各处理组血睾屏障的超微结构损伤仍很严重,波形蛋白表达量仍下降(P<0.05或P<0.01)。以上结果表明,MA和MC可以破坏小鼠睾丸血睾屏障结构,导致支持细胞骨架结构崩解,说明血睾屏障结构的破坏在MA和MC引发的雄性生殖毒性作用中发挥了关键的作用。2.体外试验以小鼠TM4支持细胞株为试验对象,采用MTT、透射电镜、流式细胞仪、Western Blot等方法,观察不同浓度MA(0-1000ug/mL)对支持细胞的毒性作用。结果可见,TM4细胞在50ug/mL及以上的MA作用24h后,细胞存活率显著下降(P<0.05或P<0.01)；在30-500ug/mL的MA作用24h后,细胞的超微结构出现了明显损伤,高浓度MA促进细胞凋亡(P<0.05或P<0.01)；在50ug/mL MA分别作用0、1、3、6、24h后,波形蛋白随着时问延长表达量下降。以上结果表明低浓度的MA即可对TM4支持细胞产生明显的损伤,提示支持细胞可能是MA生殖毒性作用的重要靶点细胞。上述体内和体外试验观察研究结果表明,在本试验剂量条件下MA单独和MC混合灌服均可引起雄性小鼠睾丸组织明显的损伤,精子畸形率升高,造成损伤的主要机制可能是由于MA和MC靶向于支持细胞破坏血睾屏障结构,继而引起各级生精细胞发生变性坏死、凋亡加剧,以致精子生成障碍、发育畸形。