目的:2型糖尿病的病因极为复杂,目前尚未完全清楚,但其发病的中心环节是胰岛素抵抗和胰岛素的分泌缺陷,胰岛素分泌缺陷在从NGT到IGT和IGT到糖尿病的过程,起了决定性的作用。长期高血糖、高血脂是胰岛素分泌缺陷发生的始动因素,也是糖尿病的重要特征。糖脂毒性可以损伤在胰岛素分泌中起重要作用的转录因子胰腺十二指肠同源盒(PDX-1),使得胰岛素分泌减少。机体发育成熟后,PDX-1作为转录因子在胰腺中特异性表达,可以促进胰腺的早期发育和晚期胰岛细胞的分化,调节胰岛素基因及胰岛素分泌相关基因的表达,影响胰岛素的合成分泌。PDX-1表达受损导致的胰岛素分泌减少,进一步加重了糖尿病的糖脂代谢紊乱。因此,研究糖尿病发生发展过程中PDX-1的表达变化,寻找和发现调控PDX-1表达和功能的药物,对阐明糖尿病发病机制、进行有效的治疗和减缓糖尿病的发展均具有重要意义。噻唑烷二酮类(thiazolidinedine,TZD)胰岛素增敏剂是过氧化物酶增殖活化受体的激活剂,这类药物在改善胰岛素抵抗方面已在临床上得到广泛应用,近年来研究显实,噻唑烷二酮可能有助于保护和改善胰岛细胞功能,但其对胰岛细胞功能作用及其机制尚未完全清楚。有关TZD是否通过调控PDX-1基因的表达,改善胰岛细胞功能,目前报道也较为少见。因此,本实验拟通过观察长期高脂饮食加小剂量STZ诱导的大鼠糖尿病模型中胰岛素变化和PDX-1的表达变化,探讨PDX-1在糖尿病发病中的作用;并通过应用TZD类药物罗格列酮(rosiglitazone)进行干预,探讨TZD改善胰岛细胞功能的作用机制。方法:健康Whistar雄性大鼠45只,适应性喂养2周,随机分为普通饮食组(A组)15只,和高脂饮食组30只,给予高脂饮食喂养2月,按HOMA指数判断出现胰岛素抵抗后,腹腔注射STZ(streptozotocin,STZ )造模。将成模大鼠(共24只)随机分为两组(每组12只): 2型糖尿病未干预组(B组),继续高脂饲料喂养;罗格列酮治疗组(C组)高脂饲料加罗格列酮,继续喂养2个月。所有大鼠实验期间自由饮水、进食。分笼饲养,每笼4-5只。每组大鼠均于实验开始、结束时称量体重、取血。大鼠自试验前一日20:00起禁食,试验日8:00分别自内眦静脉采血,分离血清,保存于-20℃,用于各指标的检测。实验结束时留取胰腺组织一部分液氮保存,用于测定InsulinmRNA和PDX-1RNA表达;一部分组织-80冻存,用于测定PDX-1蛋白表达;其余部分以4%中性多聚甲醛固定,待组织学检查。1血糖、胰岛素的测定血糖用葡萄糖氧化酶法测定;胰岛素用放射免疫法测定。采用稳态模型(Homeoestasis Model Assessment,HOMA)及胰岛素敏感指数(Insulin Sensitivity Index,ISI)评价胰岛素抵抗的程度。2血脂的测定甘油三脂(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterole, TC)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensity lipoprotein–cholesterole,HDL-C)比色法测定, Cu2+比色法测定游离脂肪酸(FFA)含量。3口服糖耐量试验(OGTT)大鼠试验结束前行OGTT试验。步骤如下:大鼠自试验前一日20:00起禁食,试验日8:00用葡萄糖灌胃2.0g/kg体重,于灌胃前(0min)、灌胃后30 min、60min、120 min、180min分别自内眦静脉采血0.5-1ml,测血糖、胰岛素。即刻测血糖,余血标本离心,血清贮存于-20℃冰箱待检。4胰腺组织InsulinmRNA和PDX-1mRNA表达的测定用Trizol Kit提取胰腺组织RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别扩增Insulin、PDX-1和β- actin mRNA,扩增产物经琼脂糖电泳、摄片和计算机图像扫描。RT-PCR产物半定量:因β- actin在组织中均匀表达, Insulin、PDX-1基因的表达水平用靶基因与β- actin的比值表示。5胰腺组织PDX-1蛋白表达的测定提取胰腺组织总蛋白并考马氏亮蓝G250法进行蛋白定量,依照常规Western Blot操作步骤进行,凝胶成像系统对所获条带进行分析。PDX-1蛋白的表达水平用PDX-1与β- actin的比值表示。6形态学检查常规方法制备大鼠胰腺光镜组织切片,行HE及Insulin、PDX-1免疫组化染色。7统计学处理所有数据用SPSS11.0软件处理,计量资料以均数±标准差((x|—)±S)表示,组间差异用两样本均数的t检验进行比较,两组以上比较采用单因素方差分析作统计学处理。检验的显著性用P值表示。P<0.05为差异有显著性,P<0.01为差异有极显著性。结果1对体重的影响实验初,大鼠随机分组,各组体重无统计学差别,具有可比性。实验末,模型组体重(398.67±26.83g)明显高于正常对照组(370.93±16.60g),有显著性差异(P<0.01)。罗格列酮干预组(388.87±17.86g)体重与正常对照组相比有显著性差异(P<0.01),与糖尿病模型组比较虽有降低的趋势,但无统计学意义。2对血脂的影响STZ造模后模型组大鼠的(TC)、(TG)、及FFA均明显升高,与正常组相比有显著性差异(P<0.01);HDL降低,与正常组相比有显著性差异(P<0.01)。罗格列酮干预组的(TC)、(TG)、及FFA比模型组明显降低(P<0.01),但仍高于正常组(P<0.05-0.01);HDL经干预后模型组升高(P<0.05),但仍低于正常对照组(P<0.01)。3 OGTT结果实验结束时,空腹血糖及葡萄糖灌胃后30、60、120、180min各时间点血糖糖尿病模型组均明显高于NC组(P<0.01)。罗格列酮干预组各时间点血糖均明显低于模型组(P<0.01)。胰岛素抵抗指数模型组(2.96±0.34)明显高于正常对照组(1.13±0.23)(P<0.01),而胰岛素敏感指数(-6.06±0.29)明显低于正常组(-4.38±0.22)(P<0.01),经罗格列酮治疗后两者均得到改善。4葡萄糖刺激的β细胞胰岛素释放功能正常对照组空腹胰岛素水平(15.08±2.16mIU/L),血浆胰岛素于口服葡萄糖后60 min达峰值(84.83±1.73 mIU/L),约为基础值的5.6倍。糖尿病模型组空腹胰岛素水平(29.14±5.11 mIU/L)较正常组显著升高(P<0.01),血浆胰岛素于口服葡萄糖后120min达峰值(102.72±2.88 mIU/L),明显延迟且仅为基础值的3.5倍。罗格列酮干预组空腹胰岛素水平(18.04±2.30mIU/L)较模型组明显降低(P<0.01),血浆胰岛素于口服葡萄糖后60 min达峰值(80.5±1.70mIU/L),胰岛素释放曲线接近正常形态。5胰腺病理形态的改变HE染色光镜下观察,模型组大鼠胰腺与正常对照组比较无明显改变。6免疫组化胰腺组织Insulin和PDX-1蛋白表达水平变化免疫组化显示阳性胰岛β细胞胞浆呈棕黄色,模型组胰腺胰岛中胰岛素染色阳性区域面积百分比值(β/T area,%)(12.75±2.18)显著低于正常对照组(42.61±2.68),有统计学意义(P?0.01),经罗格列酮干预后(20.67±2.14)较糖尿病模型组显著增加(P?0.01),但仍低于正常对照组(P?0.01),提示经罗格列酮干预后胰岛细胞数量明显增加;光密度各组无显著性差异,提示各组间β细胞内胰岛素含量无明显差异。PDX-1在胰岛细胞胞浆和胞核中均有表达,糖尿病模型组(0.240±0.051)的表达水平较正常对照组(0.648±0.087)显著降低,经罗格列酮干预后(0.460±0.045) PDX-1表达较模型组显著增高(P?0.01),较正常组仍处于低水平(P?0.01)。7胰腺组织Insulin mRNA和PDX-1 mRNA表达水平的变化在模型组大鼠胰腺组织Insulin mRNA(0.21±0.023)和PDX-1mRNA(0.153±0.071)的表达明显低于正常对照组(0.527±0.025)和(0.49±0.032)(P<0.01),罗格列酮干预组(0.351±0.035)和(0.370±0.029)与模型组比较明显增高(P<0.01)。8WesternBlot胰腺组织PDX-1蛋白表达水平变化模型组胰腺PDX-1蛋白表达水平(0.253±0.028)明显低于正常对照组(0.720±0.036)(P<0.01),给予罗格列酮治疗后(0.59±0.050)表达增强(P<0.01),但仍低于正常对照组。结论1长期高脂饲养并小剂量STZ腹腔注射可成功复制2型糖尿病实验模型,表现在血糖、血脂增高,β细胞量减少,葡萄糖刺激的胰岛素分泌第一时相明显减弱,第二时相高峰延迟。22型糖尿病大鼠血糖、血脂增高,β细胞量减少同时,InsulinmRNA和PDX-1mRNA及其相应蛋白的表达水平均下降,提示了PDX-1在糖尿病发病中的作用。3PPAR-γ激动剂罗格列酮干预后,InsulinmRNA和PDX-1mRNA及其各自蛋白的表达水平明显升高,胰岛β的量和功能也得到改善。罗格列酮可能通过增强PDX-1基因的表达,使胰岛细胞功能得到改善。因此,PPAR-γ激动剂具有保护胰岛β细胞功能延缓糖尿病进展的潜力和巨大的应用前景。