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研究背景：
药物代谢的有效性和毒副作用影响着疾病的治疗效果及用药安全。遗传药理学及药物基因组学等相关研究表明，药物代谢酶的基因多态性是导致药物代谢个体差异的关键因素，因此从药物代谢酶基因多态性的检测出发，通过新的基因分型技术的应用而提供即时有效的个体差异信息，对于临床医生给处合理的治疗方案，在药物使用安全性、有效性及指导个体化用药方面具有重要意义。
即时检验或床旁检测（Point-of-Care Testing，POCT）是检验医学自动化和简单化发展的产物，其技术便捷、快速，不需要昂贵的仪器设备及专业的技术操作人员，随着高效快节奏社会运转模式的需要，POCT已经在医学健康领域，海关检疫、农牧业、林业、消防、环境和食品检测等多个领域得到了广泛应用。但目前多集中在基于免疫学范畴的快速层析检测，实现基因分型（即单核苷酸多态性检测）的产品还鲜有报道。
《中国心血管病报告2010》显示，我国每年300万人死于心血管疾病，居死因之首，其用药安全和有效性备受关注。氯吡格雷为抗血栓治疗临床一线用药，然而，约30%患者服用该药后疗效不佳，甚至产生严重不良反应。已有文献研究表明，氯吡格雷抵抗与细胞色素P450酶CYP2C19基因多态性相关，其中CYP2C19*2(c.681G＞A)、CYP2C19*3(c.636G＞A)等位基因是增加心肌梗死、中风和支架内血栓再形成的主要影响因素。美国FDA发布氯吡格雷早期安全性信息公告，在说明书中添加黑框警告，警示语是基于对氯吡格雷抗血小板机理的认识，因为它主要依赖于细胞色素P450(CYP)体系对氯吡格雷的激活。CYP2C19功能减退的患者因为遗传多态性的缘故代谢氯吡格雷的能力差，急性冠脉综合征(ACS)和经皮冠状动脉介入后心血管不良事件的发病率高于CYP2C19功能正常的患者。因此，氯吡格雷具有潜在因减效而增加心血管事件风险，无法在弱代谢患者体内充分发挥作用，提示需开展CYP2C19功能遗传差异性的检验。
目的：
本研究以纳米金磁微粒为载体，构建了适用于CYP2C19基因分型的POCT快速层析检测体系，围绕心血管相关疾病氯吡格雷个体化用药，以335例中国人心血管相关疾病的患者血液样本为研究对象，对氯吡格雷代谢相关联的P450酶CYP2C19*2(c.681G＞A)、CYP2C19*3(c.636G＞A)等位基因进行分型，并通过金标准的测序法对基于纳米金磁微粒的快速层析检测体系进行了评价。用统计学方法对基因型进行分析，揭示中国人心血管相关疾病的患者等位基因CYP2C19*2(c.681G＞A)、CYP2C19*3(c.636G＞A)发生频率，进而对氯吡格雷药物代谢类型进行统计分析，为氯吡格雷个体化用药提供相应的理论及技术支持。
方法及主要研究结果：
1．利用水热合成法制备表面修饰有油酸分子、平均粒径为8nm、饱和磁化强度为55.1emu/g的单分散性的Fe3O4纳米粒子。采用氧化Fe3O4纳米粒子表面的油酸及表面活性剂协同作用使其转移至水相。以Fe3O4纳米粒子为种子，结合表面电荷作用利用原位自催化还原制备得到一种新型结构的Fe3O4／Au／Fe3O4花瓣状纳米金磁复合微粒。通过XRD、FT-IR、UV-Vis、VSM、EDS、ICP和HTEM等分析手段对产物进行了鉴定与表征。结果表明：其金磁复合微粒平均粒径为38nm，饱和磁化强度约为40.7emu/g，对抗地高辛单克隆抗体的固定化容量高达307μg/mg，光学特征吸收峰位于可见区的540nm左右，表面zeta-电位大于+30mV，是一种超顺磁性，胶态稳定性极好的纳米级金磁复合微粒。
2．通过对等位基因CYP2C19*(c.681G＞A)、CYP2C19*3(c.636G＞A)突变位点的引物设计及标记，利用AS-PCR扩增获得特定的扩增片段，标记有地高辛分子的PCR产物在与所构筑的基因分型检测体系中纳米金磁微粒表面抗地高辛单抗相互作用，通过侧向流层析技术便可实现CYP2C19的SNP(Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态性)快速检测。以构建的质粒DNA为模版，选择AS-PCR方法，对快速层析检测系统进行条件的优化、性能评估，结果表明：1mg纳米金磁复合微粒标记地高辛单抗最佳用量为180μg，制备得到的SNP快速层析检测试纸条对突变位点检测的灵敏度可以达到0.1%。
3．以335例中国人心血管相关疾病的患者血样为研究对象，利用开发的基因分型快速层析检测方法结合测序对CYP2C19*2(c.681G＞A)、CYP2C19*3(c.636G＞A)的基因突变位点进行双盲检测，经过统计分析：两种方法对样本的检测结果均符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则；以测序检测结果为标准，新开发的SNP快速层析检测方法准确率高于98%，两种检测方法的检出准确性不存在显著性差异；SNP快速层析检测方法检出率明显高于测序法，在检出率上存在极显著性差异，表明方法具有更高的灵敏度。对检测的中国人心血管相关患者血样的基因型进行统计分析，此类人群对药物氯吡格雷代谢类型分布为：快代谢：40.8%；中代谢：43.2%：慢代谢：16.0%。
以新型纳米金磁复合微粒为载体，建立的SNP快速层析检测方法，操作简单、便捷、快速且有着很高的特异性与灵敏度。该检测系统无需过高的技术操作壁垒，无需配置仪器设备，因此可普及于各级医疗机构、体检中心，只需具备规范的PCR实验室，即可将将个体化用药检测推向规范化和产业化进程，为疾病的临床药物开发研究及治疗研究奠定基础。
药物代谢的有效性和毒副作用影响着疾病的治疗效果及用药安全。遗传药理学及药物基因组学等相关研究表明，药物代谢酶的基因多态性是导致药物代谢个体差异的关键因素，因此从药物代谢酶基因多态性的检测出发，通过新的基因分型技术的应用而提供即时有效的个体差异信息，对于临床医生给处合理的治疗方案，在药物使用安全性、有效性及指导个体化用药方面具有重要意义。
即时检验或床旁检测（Point-of-Care Testing，POCT）是检验医学自动化和简单化发展的产物，其技术便捷、快速，不需要昂贵的仪器设备及专业的技术操作人员，随着高效快节奏社会运转模式的需要，POCT已经在医学健康领域，海关检疫、农牧业、林业、消防、环境和食品检测等多个领域得到了广泛应用。但目前多集中在基于免疫学范畴的快速层析检测，实现基因分型（即单核苷酸多态性检测）的产品还鲜有报道。
《中国心血管病报告2010》显示，我国每年300万人死于心血管疾病，居死因之首，其用药安全和有效性备受关注。氯吡格雷为抗血栓治疗临床一线用药，然而，约30%患者服用该药后疗效不佳，甚至产生严重不良反应。已有文献研究表明，氯吡格雷抵抗与细胞色素P450酶CYP2C19基因多态性相关，其中CYP2C19*2(c.681G＞A)、CYP2C19*3(c.636G＞A)等位基因是增加心肌梗死、中风和支架内血栓再形成的主要影响因素。美国FDA发布氯吡格雷早期安全性信息公告，在说明书中添加黑框警告，警示语是基于对氯吡格雷抗血小板机理的认识，因为它主要依赖于细胞色素P450(CYP)体系对氯吡格雷的激活。CYP2C19功能减退的患者因为遗传多态性的缘故代谢氯吡格雷的能力差，急性冠脉综合征(ACS)和经皮冠状动脉介入后心血管不良事件的发病率高于CYP2C19功能正常的患者。因此，氯吡格雷具有潜在因减效而增加心血管事件风险，无法在弱代谢患者体内充分发挥作用，提示需开展CYP2C19功能遗传差异性的检验。
目的：
本研究以纳米金磁微粒为载体，构建了适用于CYP2C19基因分型的POCT快速层析检测体系，围绕心血管相关疾病氯吡格雷个体化用药，以335例中国人心血管相关疾病的患者血液样本为研究对象，对氯吡格雷代谢相关联的P450酶CYP2C19*2(c.681G＞A)、CYP2C19*3(c.636G＞A)等位基因进行分型，并通过金标准的测序法对基于纳米金磁微粒的快速层析检测体系进行了评价。用统计学方法对基因型进行分析，揭示中国人心血管相关疾病的患者等位基因CYP2C19*2(c.681G＞A)、CYP2C19*3(c.636G＞A)发生频率，进而对氯吡格雷药物代谢类型进行统计分析，为氯吡格雷个体化用药提供相应的理论及技术支持。
方法及主要研究结果：
1．利用水热合成法制备表面修饰有油酸分子、平均粒径为8nm、饱和磁化强度为55.1emu/g的单分散性的Fe3O4纳米粒子。采用氧化Fe3O4纳米粒子表面的油酸及表面活性剂协同作用使其转移至水相。以Fe3O4纳米粒子为种子，结合表面电荷作用利用原位自催化还原制备得到一种新型结构的Fe3O4／Au／Fe3O4花瓣状纳米金磁复合微粒。通过XRD、FT-IR、UV-Vis、VSM、EDS、ICP和HTEM等分析手段对产物进行了鉴定与表征。结果表明：其金磁复合微粒平均粒径为38nm，饱和磁化强度约为40.7emu/g，对抗地高辛单克隆抗体的固定化容量高达307μg/mg，光学特征吸收峰位于可见区的540nm左右，表面zeta-电位大于+30mV，是一种超顺磁性，胶态稳定性极好的纳米级金磁复合微粒。
2．通过对等位基因CYP2C19*(c.681G＞A)、CYP2C19*3(c.636G＞A)突变位点的引物设计及标记，利用AS-PCR扩增获得特定的扩增片段，标记有地高辛分子的PCR产物在与所构筑的基因分型检测体系中纳米金磁微粒表面抗地高辛单抗相互作用，通过侧向流层析技术便可实现CYP2C19的SNP(Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态性)快速检测。以构建的质粒DNA为模版，选择AS-PCR方法，对快速层析检测系统进行条件的优化、性能评估，结果表明：1mg纳米金磁复合微粒标记地高辛单抗最佳用量为180μg，制备得到的SNP快速层析检测试纸条对突变位点检测的灵敏度可以达到0.1%。
3．以335例中国人心血管相关疾病的患者血样为研究对象，利用开发的基因分型快速层析检测方法结合测序对CYP2C19*2(c.681G＞A)、CYP2C19*3(c.636G＞A)的基因突变位点进行双盲检测，经过统计分析：两种方法对样本的检测结果均符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则；以测序检测结果为标准，新开发的SNP快速层析检测方法准确率高于98%，两种检测方法的检出准确性不存在显著性差异；SNP快速层析检测方法检出率明显高于测序法，在检出率上存在极显著性差异，表明方法具有更高的灵敏度。对检测的中国人心血管相关患者血样的基因型进行统计分析，此类人群对药物氯吡格雷代谢类型分布为：快代谢：40.8%；中代谢：43.2%：慢代谢：16.0%。
以新型纳米金磁复合微粒为载体，建立的SNP快速层析检测方法，操作简单、便捷、快速且有着很高的特异性与灵敏度。该检测系统无需过高的技术操作壁垒，无需配置仪器设备，因此可普及于各级医疗机构、体检中心，只需具备规范的PCR实验室，即可将将个体化用药检测推向规范化和产业化进程，为疾病的临床药物开发研究及治疗研究奠定基础。