研究背景:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）的发病机制不清,目前无有效的方法延缓或者阻断OA的进展。软骨细胞是关节软骨中仅有的细胞种类,在维持软骨的合成和分解代谢平衡中起重要作用。研究表明,内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）介导的软骨细胞凋亡在OA的发病中起重要作用。软骨细胞凋亡可以导致软骨细胞外基质合成和降解代谢失衡,而这种改变又促进软骨细胞凋亡的发生,从而加速OA的病理进程。ERS介导的细胞凋亡主要受PERK-eIF2α-ATF4通路调节,激活转录因子4（activating transcription factor 4,ATF4）是其中的关键分子,其高表达可以激活其下游促凋亡相关基因的表达,从而引起细胞凋亡。然而ATF4在OA中的表达调控及其促细胞凋亡作用仍不清楚。明确ERS在OA关节软骨退变中的作用及其表达调控,对于明确OA的发病机制以及采取有效方法延缓或者阻断OA关节软骨退变有着积极的意义。目的:探讨ATF4介导的软骨细胞凋亡在OA中的作用;同时研究OA时是否由于软骨中降低的组蛋白去乙酰化酶4（histone deacetylase 4,HDAC4）对ATF4的抑制减弱而导致ERS持续激活,引起软骨细胞凋亡;通过大鼠OA模型,探讨补充HDAC4是否可以通过抑制ATF4介导的ERS减少软骨细胞凋亡,从而延缓OA关节软骨退变。方法:1.观察人OA关节软骨是否存在ERS、ATF4的高表达、软骨细胞凋亡情况以及HDAC4在OA时其含量的变化:OA病人行全膝表面置换切取的膝关节软骨标本,取相对正常的关节软骨组织（Outerbridge I级）及OA软骨组织（Outerbridge III级）,通过Tunel染色,观察软骨组织细胞凋亡程度;通过免疫组化,Western blot及real-time qPCR检测HDAC4及ERS相关指标ATF4、CHOP、GRP78、Caspase12在蛋白和mRNA水平的表达情况。2.研究HDAC4对ATF4介导的ERS的表达调控机制:（1）实验1:培养大鼠肋软骨细胞,实验组填加终浓度为300μM的H₂O₂处理12小时,对照组不予处理,然后通过real-time qPCR检测ERS相关指标ATF4、CHOP、GRP78、Caspase12的表达情况,构建体外ERS模型。（2）实验2:在实验1基础上,实验组转染HDAC4质粒及HDAC4 siRNA分别上调及下调软骨细胞中的HDAC4,对照组转染negative control质粒及siRNA,转染24小时后,加入终浓度为300μM的H₂O₂处理12小时,诱导体外ERS。流式细胞术检测细胞凋亡,Real-time qPCR,Western blot检测ATF4、CHOP、GRP78、Caspase12在mRNA和蛋白水平的表达情况。3.构建大鼠ACLT膝关节OA模型,关节腔注射腺病毒（adenovirus,Ad）介导的HDAC4,观察HDAC4是否可以通过抑制ATF4,减少ERS触发的软骨细胞凋亡,起到延缓OA关节软骨退行性变的作用:52只8周雄性SD大鼠随机分为3组:ACLT+Ad-GFP组（n=17）（Ad-GFP组）,ACLT+Ad-HDAC4-GFP组（n=20）（Ad-HDAC4组）,假手术+Ad-GFP组（n=15）（Sham组）,术后48小时注射相应病毒,然后每3周注射1次。注射后3天、2周、3周于Ad-HDAC4组各取1只大鼠处死,行膝关节软骨切片,荧光显微镜观察HDAC4-GFP在关节软骨的表达情况。腺病毒注射后2周,Ad-GFP组和Ad-HDAC4组各处死2只大鼠,行Real-time qPCR检测关节软骨中HDAC4的表达量。其他动物术后8周处死。观察指标:（1）膝关节X线:观察骨赘形成情况;（2）印度墨水染色和番红固绿染色观察关节软骨破坏程度及蛋白多糖丢失情况;（4）免疫组织化学及Real-time qPCR检测ATF4、CHOP、GRP78及CollagenⅡ（ColⅡ）的表达情况;（5）Tunel染色:观察软骨细胞凋亡情况。结果:1.人软骨番红固绿染色可见相对正常软骨关节面较平整,软骨浅表层蛋白多糖略有丢失,软骨细胞排列较整齐,而OA关节软骨表面破坏,软骨蛋白多糖大量丢失,软骨细胞呈簇状排列。Tunel染色显示,OA软骨细胞的凋亡率明显高于相对正常软骨组织（P<0.05）。免疫组化结果表明,和相对正常软骨相比,OA关节软骨ATF4表达升高,而HDAC4表达降低,Real-time qPCR结果与免疫组化一致;Western Blot进一步证实了免疫组化和Real-time qPCR的结果。免疫组化显示CHOP、GRP78、Caspase12蛋白在OA软骨明显高于相对正常软骨。同样,OA关节软骨CHOP、GRP78、Caspase12的mRNA表达高于相对正常软骨（P<0.05）。2.H₂O₂刺激软骨细胞12小时,Real-time qPCR结果显示,实验组ATF4、CHOP、GRP78、Caspase12 mRNA表达高于对照组（P<0.05）,提示体外ERS模型构建成功。Real-time qPCR结果表明,上调HDAC4可降低ATF4、CHOP、GRP78、Caspase12mRNA的表达,而通过siRNA下调HDAC4表达后,上述指标的表达升高,和对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot的结果与Real-time qPCR一致。流式细胞术结果表明,在ERS条件下,上调HDAC4可减少软骨细胞凋亡,而下调HDAC4,软骨细胞的凋亡增加（P<0.05）。3.Ad-HDAC4-GFP关节腔注射,可以有效感染关节软骨组织。在注射后3天关节软骨即可见绿色荧光表达,2周达到高峰,3周时荧光表达减弱。两周时大鼠软骨组织Real-time qPCR结果表明,Ad-HDAC4组HDAC4 mRNA水平是Ad-GFP组的8.87倍。术后8周,X线结果表明Ad-HDAC4组有更少的骨赘形成,印度墨水染色显示Ad-HDAC4组软骨表面有更少的印度墨水残留;番红固绿染色表明Ad-HDAC4组关节软骨面较平整,蛋白多糖丢失较少;免疫组织化学表明Ad-HDAC4组ATF4、CHOP、GRP78蛋白表达少于Ad-GFP组,而Col II的表达高于Ad-GFP组;Real-time qPCR的结果与免疫组化结果一致。Tunel染色结果表明,Ad-HDAC4组软骨细胞凋亡率低于Ad-GFP组（P<0.05）。结论:ERS参与OA关节软骨退变的病理进程。在OA病理过程中,关节软骨中降低的HDAC4对ATF4的抑制作用减弱,导致ATF4内质网应激信号通路持续激活,触发软骨细胞大量凋亡,从而促进OA关节软骨退变。在大鼠OA模型中,HDAC4通过抑制ATF4介导的ERS,减少软骨细胞凋亡;同时促进软骨Col II的合成,从而起到延缓OA关节软骨退变的作用。