腹主动脉瘤(Abdominal aortic aneurysm,AAA)是一种动脉壁老化薄弱导致顺应性变差的主动脉扩张性疾病。随着我国老龄化程度的加剧,AAA的发病率逐年呈增高趋势,其发病过程相对隐匿且进行缓慢,一旦出现破裂,死亡率可以达到80%,对个人和社会造成了极大的负担。虽然随着检查手段和治疗手段的提升,AAA的死亡率有所下降,但是仍然未找到有效预防和治疗AAA的药物。同时,监测与预测AAA的有效生物分子标记物尚缺。所以,深入探究AAA发生发展的生物分子机制,寻找AAA有效的新靶点,开发阻断和治疗AAA的有效药物对于实现早期诊断、预防和治疗AAA具有极其重要的意义。目前研究发现腹主动脉瘤的发病机制十分复杂,是各种病理生理机制在该过程中互相融合、互相影响的结果。但是,AAA形成和发展的具体机制仍难以确定。AAA的病理生理特征包括细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)降解、免疫反应、炎症和氧化应激反应、细胞调亡、血管重塑等。单核细胞趋化蛋白-1 诱导蛋白(Monocyte chemotactic protein-1 induced protein,MCPIP1)是新近发现的由zc3h12a基因编码的具有转录活性的锌指蛋白,可以受MCP-1、IL-1β和脂多糖LPS的诱导表达。随着对MCPIP1研究的不断深入,研究发现MCPIP1作为一种多功能蛋白,可以通过转录激活及/或RNase活性参与多种疾病的细胞内分子生物病理过程,如心血管疾病、炎症、自身免疫等。同时,MCPIP1在诱导分化、自噬和凋亡上也发挥着重要作用。然而,MCPIP1在AAA中的作用机制暂无报道。所以,探究MCPIP1在AAA中的作用及其作用机制对于AAA的诊断和治疗具有重要意义。在本研究中首先通过收集腹主动脉瘤患者及对照血液和组织样本(N=10),首先通过检测血清中MCP-1、IL-1β、NF-κB浓度的变化明确MCPIP1与炎症因子的临床相关性;进而通过构建干扰MCPIP1细胞和AAA小鼠模型探究MCPIP1对血管紧张素作用平滑肌细胞增殖、迁移及炎症作用的影响,明确MCPIP1在腹主动脉瘤发病中的功能;最后通过对自噬激活剂RAPA诱导的不同组别中平滑肌细胞自噬相关蛋白表达、自噬小体的比例变化及细胞凋亡情况的探究明确MCPIP1在腹主动脉瘤发病中的作用机制。第一部分腹主动脉瘤临床样本收集及MCPIP1与AAA的相关性分析目的:收集腹主动脉瘤患者及健康人的对照血液和组织样本(N=10),首先通过ELISA检测血清中MCP-1、IL-1β、NF-κB浓度的变化;进一步对腹主动脉瘤组织样本MCPIP1的表达进行分析,明确MCPIP1与AAA的临床相关性。方法:1.收集腹主动脉瘤患者血液样本及无腹部血管病变的正常血液样本各10例,分离血清;利用ELISA检测血清中MCP-1、IL-1β、NF-κB浓度的变化,分析MCPIP1与炎症因子的相关性;2.收集腹主动脉瘤患者动脉组织及无腹部血管病变的正常组织样本各10例,qRT-PCR和Western Blot检测组织中MCPIP1的表达水平;3.所有值均以平均值±标准差(SD)表示;使用SPSS 17.0进行相关统计分析(SPSS,Inc.,Chicago,IL,USA);t检验用来评估组间的差异与单因素方差分析;采用ANOVA来对2组以上之间的方差分析进行评估;P<0.05代表显著统计学差异。结果:1.ELISA检测腹主动脉瘤患者及健康人群血清中MCP-1、IL-1β和NF-κB的含量变化分析发现:与健康对照组相比,AAA患者血清中MCP-1、IL-1P和NF-κB水平均显著升高;进一步通过对AAA患者血清中MCP-1与IL-1β和NF-κB的相关性分析发现:AAA患者的MCP-1的含量与NF-κB和IL-1β的含量呈正相关;2.利用qPCR和Western blot对AAA患者腹主动脉瘤和健康人群组织中MCPIP1在mRNA及蛋白表达水平上的检测分析发现:与健康对照相比,AAA组织中MCPIP1在mRNA水平和蛋白水平上的表达均显著增加。结论:腹主动脉瘤中炎症因子IL-1β和NF-κB的含量变化表明腹主动脉瘤中有明显的炎症浸润;腹主动脉瘤血清中MCP-1的变化及组织中MCPIP1的表达变化表明MCPIP1表达的升高可能是由于炎症因子的升高引起的。第二部分 MCPIP1在腹主动脉瘤发病中的功能分析目的:通过构建干扰MCPIP1细胞和AAA小鼠模型,通过对主动脉弹性纤维和胶原纤维的形态以及平滑肌细胞凋亡率鉴定、MCPIP1和炎性因子的表达分析及AAA小鼠模型中MCPIP1对血管紧张素作用平滑肌细胞增殖、凋亡及炎症作用的影响,明确MCPIP1在腹主动脉瘤发病中的功能。方法:1.利用血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)微泵释放法建立实验性(ApoE-/-)小鼠腹主动脉瘤模型,第0、7、14、28天进行腹主动脉直径超声测量并保留超声测量结果;取腹主动脉测量计算各组的成瘤率变化,实验分为Sham和Model组。2.EVG染色、Sirius红染色、免疫组织化学和Tunel染色评估AAA小鼠模型中的主动脉弹性纤维和胶原纤维的形态以及平滑肌细胞的凋亡率;3.HE和免疫组化检测组织中MCPIP1、CD68和CD31的表达水平变化。4.qPCR、Western Blot检测组织中MCPIP1的表达情况;Western Blot检测组织中MCP-1、IL-1β和NF-κB的表达情况;5.分离大鼠腹主动脉血管平滑肌细胞,进行扩大培养;实验分组:VSMC、VSMC+Ang-Ⅱ、VSMC+Ang-Ⅱ+si MCPIP1-NC 和 VSMC+Ang-Ⅱ+si MCPIP1 组;6.EdU检测细胞增殖能力变化,Hoechst33258/流式细胞仪检测细胞凋亡情况,流式细胞仪检测细胞周期变化;7.ELISA检测细胞上清中MCP-1、IL-1β和NF-κB的浓度变化;8.qPCR和Western blot及免疫荧光检测细胞中MCPIP1的表达水平变化及定位情况;Western blot 检测细胞中 MCPIP1、MCP-1、IL-1β、NF-κB、MMP2 和 MMP9 的蛋白表达变化;9.所有值均以平均值±标准差(SD)表示;使用SPSS 17.0进行相关统计分析(SPSS,Inc.,Chicago,IL,USA);t检验用来评估组间的差异与单因素方差分析;采用ANOVA来对2组以上之间的方差分析进行评估;P<0.05代表显著统计学差异。结果:1.通过对AAA模型小鼠在0、7、14、28天进行的腹主动脉直径超声测量分析发现,与假手术组相比,AAA模型组中在第7、14和28天时腹主动脉直径显著变大;腹主动脉平滑肌肌动蛋白HE染色和CD68免疫组织化学染色分析发现,与假手术组相比,在AAA小鼠模型腹主动脉平滑肌肌动蛋白中观察到大量炎性细胞浸润。同时,通过免疫组织化学染色、qRT-PCR和Western blot分析发现:与假手术组相比,在AAA模型组中MCPIP1的表达显著提高。此外,与假手术组相比,AAA模型组中动脉瘤组织中MCP1、IL-1β和NF-κB蛋白表达水平显著提高;2.EVG染色分析发现,与假手术组相比,AAA小鼠模型组中主动脉瘤的主动脉瓣环中间层不完整,弹性瓣环部分破裂,波形丢失;Sirius红色染料染色分析发现:与假手术组相比,AAA小鼠模型组中外膜动脉瘤中的红色胶原纤维显著减少;血管内皮细胞标志物的CD31免疫组织化学和Tunel染色分析发现,与假手术相比,尽管在AAA小鼠模型组中观察到新生血管形成,但是在AAA模型小鼠中凋亡的血管平滑肌细胞明显增加。3.MCPIP1免疫荧光组织染色分析发现:与对照相比,Ang-Ⅱ诱导后的VSMC细胞质中MCPIP1的荧光信号显著增强;进一步分析发现与Ang-Ⅱ模型组和SiRNA-NC组相比,在SiMCPIP1组中MCPIP1的荧光信号显著减弱;进一步通过qRT-PCR和Western blot对不同组别中的MCPIP1表达水平的分析发现:与Ang-Ⅱ模型组和SiRNA-NC组相比,Si-MCIPIP1组细胞中MCPIP1的表达显著降低;同时,与Ang-Ⅱ模型组和SiRNA-NC组相比,Si-MCIPIP1组细胞中MCP-1的含量也显著降低;另外,研究发现Ang-Ⅱ处理的VSMC中MMP-2和MMP-9的表达水平分别比对照高16.4倍和6.8倍(;而与Ang-Ⅱ和Si-NC组相比,SiMCPIP1组中MMP-2和MMP-9的表达分别降低了 2.4倍和6.8倍,但是依然是NC组的3.37倍。4.与对照组相比,Ang-Ⅱ处理后VSMCs细胞GO/G1期显著缩短,增殖显著增加;与Ang-Ⅱ组和Si-NC组相比,MCPIP1沉默后VSMCs的GO/G1期显著增长,增殖作用显著降低;VSMCs细胞凋亡检测分析发现与对照相比,经Ang-Ⅱ处理的VSMCs的凋亡率显著提高,提高约4.44倍;与Si-NC和Ang-Ⅱ组相比,MCPIP1沉默后VSMCs凋亡率分别降低了 1.48倍和1.72倍。结论:AAA小鼠模型中血管平滑肌中炎性浸润的增加促进了相应AAA模型中平滑肌细胞中MCPIP1的表达;Ang-Ⅱ诱导的动脉瘤小鼠的主动脉壁弹性受损;Ang-Ⅱ诱导的MCPIP1上调可能通过增加MMPs的表达来降解弹性和胶原纤维,从而破坏了主动脉壁的弹性;Ang-Ⅱ诱导的MCPIP1上调打破了 VSMC增殖和凋亡之间的失衡从而破坏了主动脉壁的弹性。第三部分MCPIP1在腹主动脉瘤发病中的作用机制探究目的:通过对自噬激活剂RAPA诱导的不同组别中平滑肌细胞自噬相关蛋白表达、自噬小体的比例变化及细胞凋亡情况的探究,明确MCPIP1在腹主动脉瘤发病中的作用机制。方法:1.培养血管平滑肌细胞并进行转染,实验分组:VSMCs对照组、VSMCs+Ang-Ⅱ组、VSMCs+Ang-Ⅱ+siMCPIP1-NC 组、VSMCs+Ang-Ⅱ+siMCPIP1 组;透射电镜检测细胞中自噬小体的比例变化,免疫荧光检测自噬LC3B的表达差异,Western Blot检测细胞中自噬相关蛋白LC3B、p62、BNIP3的差异表达;2.培养血管平滑肌细胞并进行转染,实验分组:VSMCs+Ang-Ⅱ组、VSMCs+Ang-Ⅱ+siMCPIP1 组、VSMCs+Ang-Ⅱ+si MCPIP1+1μM RAPA 组;透射电镜检测细胞中自噬小体的比例变化,免疫荧光检测自噬LC3B的表达差异,Western Blot检测细胞中自噬相关蛋白LC3B、p62、BNIP3的差异表达。流式细胞仪检测细胞凋亡情况;3.所有值均表示为平均值±标准差(SD);用SPSS 17.0进行统计分析(SPSS,Inc.,Chicago,IL,USA);t检验用于评估组间差异和单因素方差分析;ANOVA用于评估2组以上之间的方差分析;P<0.05被认为是统计学上差异达到显著。结果:1.通过对自噬相关蛋白的表达分析发现:与对照组相比,在Ang-Ⅱ诱导的AAA细胞模型中LC3BⅡ和BNIP3的表达量显著升高而LC3BⅠ和P62的表达量则显著降低;与Ang-Ⅱ和Si-NC对照组相比,在SiMCPIP1组中LC3BⅡ和BNIP3的表达量显著降低,而LC3BI和P62的表达量则显著升高;利用免疫荧光检测自噬LC3B的表达分析发现:与对照组相比,在Ang-Ⅱ诱导的AAA细胞模型中LC3B的荧光信号显著增强;与Ang-Ⅱ和Si-NC对照组相比,在SiMCPIP1组中LC3B的荧光信号显著减弱。透射电镜检测Ang-Ⅱ诱导的细胞中自噬小体的比例变化发现:与对照组相比,Ang-Ⅱ诱导的平滑肌细胞中自噬小体显著增加,但是与Ang-Ⅱ和Si-NC对照组相比,SiMCPIP1组中自噬小体小体数量显著降低。2.通过对自噬相关蛋白的表达分析发现:与Ang-Ⅱ组相比,SiMCPIP1组中LC3BⅡ和BNIP3的表达量显著降低而LC3BI和P62的表达量则显著升高;相反,在RAPA组中LC3BⅡ和BNIP3的表达量显著升高而LC3BI和P62的表达量则显著降低;免疫荧光检测自噬LC3B的表达分析发现:与Ang-Ⅱ组相比,SiMCPIP1组中LC3B的荧光信号显著减弱;在RAPA组中LC3B的荧光信号显著增强。通过透射电镜检测Ang-Ⅱ诱导的细胞中自噬小体的比例变化发现:与Ang-Ⅱ组相比,SiMCPIP1诱导的平滑肌细胞中自噬小体显著减弱,但是加入RAPA后自噬小体小体数量显著升高;细胞凋亡分析发现:与Ang-Ⅱ组相比,SiMCPIP1组中平滑肌细胞凋亡显著降低,但是在加入RAPA后细胞凋亡显著升高。结论:通过对自噬激活剂RAPA诱导的不同组别中平滑肌细胞自噬相关蛋白表达、自噬小体的比例变化及细胞凋亡情况的探究表明,SiMCPIP1可以降低由于自噬引起的平滑肌细胞的凋亡。全文结论1.AAA中炎症因子IL-1 β、NF-κB、MCP-1的含量变化变化及MCPIP1的表达变化分析表明:AAA中有明显的炎症浸润,炎症反应引起的MCPIP1表达的上调与AAA显著相关。2.通过对MCPIP1在VSMC中的功能分析发现:Ang-Ⅱ诱导的MCPIP1上调打破了VSMC增殖和凋亡之间的失衡从而破坏了主动脉壁的弹性;3.通过对自噬激活剂RAPA诱导的不同组别中平滑肌细胞自噬相关蛋白表达、自噬小体的比例变化及细胞凋亡情况的探究表明:SiMCPIP1可以降低由于自噬引起的平滑肌细胞的凋亡进而影响AAA的发生发展。