实验目的:　　 疟疾是疟原虫通过媒介昆虫蚊传播的人类最为严重的寄生原虫感染性疾病。2009年WHO疟疾报告显示,疟疾流行于非洲、亚洲和拉丁美洲等的109个国家,全球约33亿人口受到疟疾威胁。每年有大约2.5亿疟疾病例发生,近百万人死于疟疾感染。疟疾已成为全球最严重的三大公共卫生问题之一。因此,有效疟疾疫苗和抗疟新药的研制开发已经成为当今世界迫切需要解决的重点课题,而疟原虫感染宿主机体应答的免疫学、分子生物学等综合基础研究是其重要前提。　　 在体内建立适时、适度的保护性免疫应答有赖于免疫调节机制的精确调控。大量研究表明,调节性T细胞(regulatory Tcell,Treg)在宿主免疫调控网络中发挥举足轻重的作用。在鼠疟或流行区个体均已经发现疟疾感染会引起Treg数量变化。疟疾流行区研究发现,流行区个体对疟疾感染的高抵抗性源于Treg功能性缺失。恶性疟患者体内Treg的活化与疟原虫高水平增殖密切相关。同时,间日疟原虫感染中Treg数量增高与原虫负荷增加有关。但同时有研究证实Treg不能对疟疾急性期感染发挥调控作用。Hiseada等多个研究小组证实Treg能够辅助原虫逃避宿主免疫监视,Treg可能是宿主对原虫发生免疫耐受的主要原因。但近期有研究显示,消除Treg将导致宿主贫血、原虫负荷增加和病理性炎症应答等不良症状出现。因此,Treg在疟疾感染中的作用尚待深入研究。　　 我们前期的研究显示,致死型约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii17XL,P.y17XL)感染中,BALB/c小鼠的易感性与体内Treg的活化密切相关。DBA/2小d鼠在P.y17XL和致死型夏氏疟原虫(Plasmodium chabadudi chabadui AS,.P.c chabadui AS)感染中呈现截然相反的感染结局。为深入探讨Treg在疟疾感染中的作用地位,本研究动态观察了P.c chabadui AS感染DBA/2小鼠体内Treg活化特点,系统研究了P.cchabaudi AS感染中Treg对Th免疫应答的调控效应及其相关机制,以期进一步明确Treg在疟疾感染过程中的作用地位。　　 实验方法:　　 1、实验动物及其模型构建　　 6-8周龄、雌性DBA/2小鼠,经腹腔分别感染1×106 P.c chabaudi AS寄生的红细胞(pRBC),构建不同的实验动物模型。　　 2、体内CD25+T细胞消除　　 DBA/小鼠于感染前d1、感染后d1和d3,经腹腔给予抗CD25mAb(1mg/鼠/次),抗CD25mAb来自经Hi-Trap Protein G柱纯化的7D4杂交瘤细胞株接种的裸鼠腹水。与实验组对应同一时间点,对照组DBA/2小鼠经腹腔给予同体积的1×PBS。　　 3、脾细胞荧光抗体染色　　 无菌取出感染前(d0)和感染后d3、5、8、10小鼠脾脏,常规制备脾细胞悬液。取0.1ml脾细胞悬液,预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体1μg封闭30min。设阴性对照管及对应单标管。为染色CD4+CD25+Foxp3+细胞,每份样品同时用抗-CD4-FITCmAb和抗-CD25-PE mAb进行细胞表面双色标记,4℃孵育30min。每管加0.25ml固定透膜剂,4℃孵育1h。再加入抗-Foxp3-APC mAb进行胞内染色,4℃孵育30min。用0.5ml FBS/PBS重悬细胞,待流式细胞仪进行检测。为染色胞内Ig表达水平,每份样品同时用抗-B220-PerCP和抗-CD138-PE mAb进行细胞表面双色标记,4℃孵育30min。每管加0.25mlBD固定透膜剂,4℃孵育1h。再加入抗-IgG1-FITC或抗-IgG2a-FITC mAb进行胞内染色,4℃孵育30min。用0.5ml FBS/PBS重悬细胞,待流式细胞仪进行检测。　　 4、IFN-γ和TNF-α定量检测　　 采用ELISA方法,分别检测经培养48h脾细胞上清IFN-γ和TNF-α分泌水平。酶标仪测定450nm处OD值。结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线,应用SoftMax Pro4.3.1LS软件分析,计算细胞因子含量(pg/ml)。　　 5、NO水平检测　　 Griess方法检测经培养48h脾细胞上清中NO2-水平。计算其含量(μM)。　　 6、CD4+T细胞凋亡水平检测　　 常规收集脾细胞,调细胞浓度1×105个/管。设阴性对照管和单标管。每管加抗-CD4-FITC mAb进行细胞表面染色,4℃孵育30min。再加入5ul7-AAD和5ulPE-Annexing-V原液,轻柔震动,37℃避光孵育15分钟。每管加0.5ml FBS/PBS,轻柔震动,待流式细胞仪进行检测。　　 7、统计学分析　　 应用SPSS11.5统计学分析软件,Students test比较分析组内和组间均值的差异。P小于或等于0.05为差异显著。　　 实验结果:　　 1、P.c chabaudi AS感染小鼠原虫血症水平和生存率　　 DBA/2小鼠腹腔接种1×106 P.c chabaudi AS寄生的红细胞(pRBC)后,于感染后d5在外周血中可见疟原虫感染的红细胞,随后红细胞感染率迅速上升。在感染后d5-7期间,红细胞感染率从1％升至28％。在感染后d8-9,红细胞感染率达到峰值(40.3％)。DBA/2小鼠于感染峰值后全部死亡。疟原虫感染的红细胞在Treg消除鼠外周血中延迟出现(d6-7),红细胞感染率在达峰值前(d5-7)明显低于对照组。并且,原虫血症达峰值(37.5％)时间延迟至感染后d10。随后,红细胞感染率陡然下降,在感染后d10-15从35％降至3％,在感染后d20疟原虫被彻底清除,小鼠生存期明显延长。　　 2、P.c chabaudi AS感染小鼠CD4+CD25+Foxp3+细胞数量　　 与na(I)ve小鼠相比,在感染后d5-10,DBA/2小鼠感染P.c chabaudi AS后Foxp3表达水平明显增加。为此,我们以na(I)ve小鼠表达Foxp3荧光强度为标准,Foxp3表达荧光强度高于103以上者视为Foxp3hi。与na(I)ve小鼠相比,在感染后d5-10,DBA/2小鼠CD4+CD25+Foxp3+细胞总数增加了2-5倍,CD4+CD25+Foxp3hi细胞总数增加了约6-30倍。CD4+CD25+Foxp3hi占CD4+T细胞百分含量比从初始0.1％增至峰值2％。在感染后d5-10,CD4+CD25+Foxp3hi细胞比CD4+CD25+Foxp3+细胞的增殖幅度明显。　　 Treg消除鼠感染P.c chabaudi AS后CD25表达一过性短暂下调,随后出现明显回升。在感染后d8,Treg消除组脾脏CD4+CD25+Foxp3+细胞百分含量与对照组无明显差异。相比,Treg消除组Foxp3表达水平明显降低且维持较长时间。与对照组相比,Treg消除组从感染后d3,Foxp3表达有降低趋势。在感染后d5-8明显下降,于感染后d10,Foxp3表达回升至对照组水平。在感染后d3,Treg消除组脾脏CD4+CD25+Foxphi细胞总数是对照组的30％,随着对照组CD4+CD25+Foxphi细胞总数的增加,Treg消除组CD4+CD25+Foxphi细胞所占其比例进一步降低。在对照组CD4+CD25+Foxphi细胞总数达峰值时,Treg消除组CD4+CD25+Foxphi细胞总数是对照组的15％。　　 3、P.c chabaudi AS感染小鼠脾细胞培养上清前炎症因子水平　　 为明确Treg对Th1型免疫应答的影响,我们检测脾细胞培养上清中前炎症细胞因子水平。与na(I)ve小鼠相比,DBA/2小鼠感染p.c chabaudi AS后d3-5,前炎症细胞因子IFN-γ和TNF-α明显增加,且巨噬细胞活化特征性标志NO水平亦明显增加。与对照组相比,Treg消除组于感染后IFN-γ、TNF-α和NO的分泌水平进一步增强。　　 4、P.c chabaudi AS感染小鼠脾脏浆细胞数量　　 为确定Treg是否调控由Th2细胞介导的体液免疫应答,我们检测了B220lowCD138+浆细胞、胞内合成IgG1(iIgG1+)和胞内合成IgG2a(ilgG2a+)的细胞数量。与对照组相比,Treg消除组脾脏B220lowCD138+总浆细胞数量在感染后d8出现一过性降低,在感染后d10恢复至对照组水平。在感染后d10,Treg消除组脾脏iIgG1+和iIgG2a+细胞总数与对照组相比无明显差异。　　 5、P.c chabaudi AS感染小鼠脾脏IL-12+细胞数量　　 与na(I)ve小鼠相比,在感染后d3-5,DBA/2小鼠胞内合成IL-12(IL-12+)的细胞总数增加。与对照组相比,在感染后d3-5,Treg消除组IL-12+细胞总数增加更为明显。　　 6、P.c chabaudi AS感染小鼠脾脏CD4+T细胞凋亡水平　　 与对照组相比,在感染后d3-5,Treg消除组的CD4+T细胞凋亡数量明显降低。　　 7、P.c chabaudi AS感染小鼠脾细胞培养上清IL-10和TGF-β水平　　 与对照组相比,在感染后d5-8,Treg消除组脾细胞上清IL-10水平明显升高。而TGF-β水平变化趋势与对照组相比无明显差异。　　 结论:　　 1、P.c chabaudi AS感染导致DBA/2小鼠脾脏CD4+T细胞Foxp3表达增高。扩增的CD4+CD25+Foxp3hi细胞与原虫负荷密切相关,明显影响着疟疾感染的进程和最终结局。　　 2、P.c chabaudi AS感染早期,CD4+CD25+Foxp3hi细胞可降低合成分泌IL-12的细胞数量,且诱导效应CD4+T细胞凋亡,进而对Th1型前炎症细胞因子的分泌发挥免疫抑制作用。　　 3、P.c chabaudi AS感染中,CD4+CD25+Foxp3hi细胞对浆细胞数量无明显抑制作用。