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苦荞是一种兼具药用和保健功能的小杂粮,芦丁含量是其主要的质量性状和经济指标。黄酮醇合酶（FLS）及其同源基因是苦荞芦丁合成和积累的关键酶和限制因素,其转录强度、编码产物的催化特征是引起苦荞黄酮醇种类和含量差异的重要原因。本研究以5条苦荞黄酮醇合酶基因Ft FLS1-5为研究对象,分析苦荞全生长期Ft FLS1-5的时空表达模式和黄酮类物质含量的相关性;采用转基因技术,鉴定其在拟南芥中的生物学活性,分析其对拟南芥黄酮合成相关基因表达和代谢产物积累的影响;采用原核表达亲和层析技术,分离纯化重组Ft FLS1-5蛋白并利用HPLC技术测定其体外催化特征。本研究初步阐明了苦荞Ft FLS1-5的分子特征,鉴定了其在拟南芥体外内的活性,明晰了苦荞黄酮醇合成支路的主效基因,为未来进行高芦丁苦荞的分子育种提供理论依据和基础材料。主要结果如下:1.基于苦荞转录组和基因组测序结果,对Ft FLS1-5分子特征进行分析。结果表明,苦荞基因组中有5条FLS同源序列,其ORF与Ft FLS1-5一致。Ft FLS1和Ft FLS2定位于苦荞第7号染色体,且属于串联重复序列;Ft FLS3定位于苦荞第2号染色体,Ft FLS4定位于苦荞第3号染色体;Ft FLS5定位于苦荞第1号染色体。序列分析显示,Ft FLS1、Ft FLS2、Ft FLS3和Ft FLS5均含有3个外显子和2个内含子,Ft FLS4含有2个外显子和1个内含子;Ft FLS1-5的外显子序列同源性为75.7%,而内含子在数目、大小、位置和碱基序列差异较大,显示出苦荞FLS同源基因在进化和功能分化中存在差异。基于参与苦荞黄酮代谢的2-ODD蛋白的进化树分析结果表明,Ft FLS1和Ft FLS3具有最近的系统发育关系,与典型的植物FLS聚为一簇;Ft FLS2与花青素合酶（ANS）具有相对接近的进化关系,Ft FLS5与黄烷酮3-羟化酶（F3H）归为一类,Ft FLS4独立于进化树中所有分支与其它Ft FLS及2-ODD蛋白关系较远。2.苦荞全生长期黄酮类物质测定结果表明,芦丁为苦荞主要的黄酮,从整体上看,叶片（1.22%）、花（1.46%）和种子（1.10%）中芦丁含量较高,根（0.044%）和茎（0.12%）中芦丁含量较低。花青素在苦荞幼苗期的茎中积累量最高（0.19%）,在花期各组织花青素含量为0.026～0.074%,其余时期各组织花青素含量为0.017-0.078%。q RT-PCR结果显示,Ft FLS1-5在苦荞全生长期的各组织部位的表达具有时空和组织特异性。苦荞全生长期中,Ft FLS1的表达量随着生殖器官的分化急剧上调表达,并在Stage 5中的未成熟种子中达到顶峰,种子成熟时表达量略有下降;Ft FLS2和Ft FLS4的表达具有相似的模式,在未分化出生殖器官前（Stage 1～2）,主要在苦荞幼苗的根和茎中表达,进入生殖阶段后在花和种子中表达且变化趋势不明显（P＞0.05）;Ft FLS3和Ft FLS5在苦荞全生长期各部位均有一定表达水平,其变化趋势不显著（P＞0.05）。进一步分析苦荞全生长期Ft FLS1-5表达量与黄酮类物质含量进行相关性分析,结果表明,Ft FLS1在全生长期的表达量与总黄酮和芦丁含量成显著正相关,与花青素的含量成显著负相关,Ft FLS2和Ft FLS4的表达量与总黄酮、芦丁以及花青素含量的均无显著相关性关系。Ft FLS3和Ft FLS5在全生长期的表达量与总黄酮和芦丁含量成显著正相关,与花青素的含量无显著相关性关系。3.构建含有Ft FLS1-5的p CAMBIA1301植物表达载体,通过农杆菌感受态细胞GV3101的介导,采用浸花法将其转化花期拟南芥。通过抗性平板以及PCR筛选鉴定,获得T3代纯合阳性植株。表型观察结果显示,转Ft FLS1-5拟南芥植株较野生型抽薹更早,在花期之前植株较野生型高大。转基因拟南芥中,Ft FLS1-5的超表达均引起拟南芥总黄酮和芦丁含量的极显著提高（P＜0.01）;Ft FLS1超表达拟南芥中花青素含量显著提高（P＜0.05）,Ft FLS5超表达拟南芥中花青素含量显著降低（P＜0.05）,Ft FLS2-4超表达拟南芥中花青素含量与野生型相近。q RT-PCR结果表明,Ft FLS1超表达拟南芥中,内源性黄酮合成相关基因At PAL、At C4H、At4CL、At CHS、At CHI、At F3H、At F3’H、At DFR和At ANS的表达均得到显著上调（P＜0.05）;Ft FLS2超表达拟南芥中,拟南芥内源的At CHS和At FLS被显著的抑制（P＜0.05）;Ft FLS3超表达拟南芥中,At PAL、At C4H、At4CL、At CHS、At CHI、At F3’H、At F3H和At FLS等基因的表达量显著提高（P＜0.05）;Ft FLS4超表达拟南芥中,显著上调了At PAL、At C4H、At4CL、At CHS、At CHI、At F3H和At FLS等基因的表达（P＜0.05）,而At F3’H、At DFR和At ANS等基因的表达量被显著抑制（P＜0.05）;Ft FLS5的超表达拟南芥中,内源性黄酮合成相关基因的变化情况与Ft FLS4超表达拟南芥中相似,显著上调了At PAL、At C4H、At CHS、At CHI、At F3H和At FLS等基因的表达（P＜0.05）,而At F3’H、At DFR和At ANS等基因的表达被极显著抑制（P＜0.05）。转基因结果显示,苦荞Ft FLS1-5在拟南芥中的转录产物均具有生物学活性,其翻译产物能引起不同的类黄酮在拟南芥中的合成和积累。4.分别构建重组质粒p ET-30（b）-Ft FLS1-5并获得转大肠杆菌的基因工程菌,经IPTG诱导表达表明,重组蛋白分子量大小约45 k Da,为可溶性产物。利用亲和层析分离纯化重组蛋白,采用HPLC法测定重组Ft FLS1-5蛋白的酶活力及比活力,结果表明:5种重组蛋白均能催化二氢槲皮素生成槲皮素,其中Ft FLS1的比活力最高(60.79×10-3IU/mg),其余4种重组蛋白的比活力在2.56～17.46×10-3IU/mg之间;Ft FLS1和Ft FLS3可催化二氢山奈酚生成山奈酚,且比活力大小相近;仅有Ft FLS1可催化二氢杨梅素生成杨梅素,其比活力为19.11×10-3IU/mg。体外活性检测结果显示,Ft FLS1可能在黄酮醇合成代谢支路中起主导作用。综上所述,苦荞基因组中共有5条FLS同源基因,Ft FLS1-5具有不同的基因结构和分子特征,其转录产物和蛋白质的生物学功能有所差异。Ft FLS1在苦荞全生长期表达模式、体外活性检测和转基因植物鉴定中显示出最高的产物相关性和最强的底物转化能力,是苦荞黄酮醇合成代谢支路的主效基因;Ft FLS3的分子特征和体内外活性结果暗示其有可能是Ft FLS1的功能性冗余和备份;Ft FLS2、Ft FLS4和Ft FLS5的体外催化能力较弱,可能参与苦荞其它黄酮（醇）的合成,其表达可能受到其他内外环境的影响。