目的：揭示肿瘤微环境启动前列腺癌细胞发生EMT并形成DTCs的分子机制,对该过程进行阻断,以减少肿瘤的复发和转移。方法：运用慢病毒转染法构建稳定表达luciferase的前列腺癌细胞系(PC3-luc, C4-2B-luc, RM-1-luc),并以皮下接种的方式建立小鼠前列腺癌模型,待肿瘤长到一定大小时,将皮下肿瘤取出再培养并运用Western blot检测EMT标记蛋白的变化；运用RT-PCR检测皮下接种前列腺癌小鼠的DTC细胞；对亲本前列腺癌细胞及小鼠皮下前列腺癌细胞进行生物学特点的比较,并探索其分子机制；此外本研究还建立了前列腺癌细胞心内注射和胫骨注射转移模型,并分离培养了特异性肺转移前列腺癌细胞。结果：本研究构建了稳定表达luciferase的前列腺癌细胞系,建立了小鼠皮下前列腺癌接种模型,检测到了小鼠骨髓中存在DTC细胞,且皮下肿瘤再培养的细胞发生了EMT改变,并获得了更强的增殖、迁移侵袭及血管再生能力。进一步的机制研究发现其可能是由于Akt调控MCP-1的表达来实现,或经Akt/AMPK α/mTOR信号通路调控所致。此外本研究建立的心内注射小鼠模型和胫骨注射小鼠模型均发生了全身多脏器的转移。结论：接种于小鼠皮下的前列腺癌细胞在体内微环境的作用下,发生了EMT转化并促进了DTCs的产生,且其获得了更强的增殖、迁移侵袭和血管形成能力。这可能是由于Akt调控MCP-1高表达或Akt/AMPK α /mTOR信号通路调控所致。心内注射及胫骨注射肿瘤模型可用于器官特异性转移的相关研究。第一部分建立稳定表达luciferase的前列腺癌细胞系目的：构建能够稳定表达luciferase的前列腺癌细胞系。方法：对pCDNA3.1、 pGL3-control、pGL4.50及包装质粒VSV-G、pRRE、 RSV-REV进行质粒的转化及扩增提取；对pCDNA3.1, pGL3-control脂质体共转染,pGL4.50脂质体转染,pGL4.50电穿孔转染法,pGLV4-EF1a-Luc慢病毒转染法构建稳定表达luciferase前列腺癌细胞株进行比较。根据GFP的表达量,运用流式细胞分选术收集高表达GFP的pGLV4-EF1a-Luc慢病毒转染的PC3-luc和C4-2B-luc细胞；构建luciferase慢病毒载体,运用菌液PCR,质粒电泳纯化双酶切及质粒测序等方法鉴定连接正确的慢病毒载体,运用VSV-G、pRRE、RSV-REV三质粒包装系统在293T细胞中进行病毒包装并转染多种细胞株,Blasticidin抗生素进行阳性筛选构建稳定表达luciferase的前列腺癌细胞株以及其他种类的细胞株。结果：在对多种转染方法比较之后,本研究最终选用购白上海吉玛公司的pGLV4-EF la-Luc慢病毒液构建了稳定表达luciferase勺PC3和C4-2B两株前列腺癌细胞系PC3-luc和C4-2B-luc,并运用流式细胞仪分选出了GFP强阳性的细胞。另外本研究自行构建了luciferase慢病毒载体,挑选出菌液PCR、双酶切、测序等方法验证正确的载体进行扩增和包装,构建了稳定表达luciferase的小鼠RM-1前列腺癌细胞株RM-1-luc以及其他种类的前列腺癌细胞株,肝癌,乳腺癌,肺癌,卵巢癌及部分耐药株等在内的荧光素酶标记细胞,以供实验室其他研究所用。结论：与脂质体转染法及电穿孔转染法相比,慢病毒转染法更适于构建稳定表达目的基因的细胞株。第二部分建立前列腺癌细胞体内发生EMT的研究模型目的：建立PC3-luc, C4-2B-luc, RM-1-luc小鼠皮下接种肿瘤模型,发现肿瘤转移的早期事件。方法：将PC3-luc细胞接种于裸鼠皮下,C4-2B-luc细胞接种于SCID小鼠皮下和RM-1-luc细胞接种于C57BL/6J小鼠皮下(2×106cells/只)；接种后每周一次活体成像,每周2次游标卡尺测量肿瘤体积并监测小鼠体重变化,实时动态观察肿瘤生长；待肿瘤长到一定大小时,将小鼠处死,取皮下肿瘤进行体外再培养(PC3-lucs1, C4-2B-lucs1, RM-l-luc s1),观察皮下肿瘤细胞的形态改变并运用WB检测与亲本细胞相比,皮下肿瘤再培养细胞EMT标志蛋白的改变。结果：成功构建了PC3-luc, C4-2B-luc, RM-1-luc皮下接种肿瘤模型并获得了皮下肿瘤生长曲线；皮下肿瘤再培养细胞与亲本细胞相比,形态发生了改变。EMT标记检测发现在与亲本细胞相比,Vimentin和snail在PC3-luc s1细胞中的表达增高,而E-cadherin, claudin-1和ZO-1在PC3-lucs1细胞中的表达下降。结论：皮下肿瘤细胞发生了EMT改变。第三部分骨髓播散肿瘤细胞的检测目的：检测皮下接种肿瘤细胞小鼠模型骨髓中是否存在DTC细胞方法：接种了肿瘤细胞的小鼠待皮下肿瘤长到一定大小时,将小鼠处死,分离髂骨、股骨和胫骨(髂骨和股骨用于分离骨髓,胫骨用于固定脱钙包埋),髂骨和股骨冲出骨髓后分别提取总RNA用于PCR检测。PC3-TxR, DU145, CNE2小鼠骨髓来自于本实验室其他课题组的皮下肿瘤细胞接种模型。总RNA逆转录后检测Luc2和Human GAPDH基因在小鼠骨髓mRNA水平的表达情况,小鼠GAPDH作为内参；胫骨置于10%中性福尔马林中固定24小时后,转入10%EDTA脱钙完全后转移至70%乙醇保存并进行石蜡包埋和切片。结果：PCR结果显示在这些肿瘤细胞接种的小鼠骨髓中有Luc2和Human GAPDH的表达,而他们在正常对照小鼠的骨髓中没有表达。结论：皮下接种了肿瘤细胞的小鼠骨髓中出现了DTCs第四部分肿瘤微环境促进前列腺癌细胞生物学功能的改变目的：检测EMT发生后,获得了间充质表型的PC3-luc s1细胞的生物学特性改变。方法：将PC3, PC3-luc和PC3-luc s1细胞分别再次注射于裸鼠皮下2×106cells/只),每周进行一次活体成像,每周两次游标卡尺测量肿瘤大小及体重监测,比较两株细胞在肿瘤生长过程中所发生的变化。待肿瘤生长到一定大小时,将小鼠处死,分离皮下肿瘤,比较组织改变；用MTS法体外比较PC3, PC3-luc和PC3-luc s1的细胞增殖情况；运用细胞划痕愈合实验及Transwell小室比较PC3, PC3-luc和PC3-luc s1三株细胞的迁移和侵袭能力。结果：在体内,PC3-luc s1小鼠皮下肿瘤比PC3和PC3-luc小鼠皮下肿瘤生长速度快,均匀且表面布有更丰富的血管；体外实验证实与PC3及PC3-luc细胞相比,PC3-luc s1细胞增殖速度并未增加,迁移和侵袭能力均有增强。结论：与PC3和PC3-luc相比,发生了EMT改变后的PC3-luc s1具有了更强的增殖,迁移侵袭和血管生成能力。第五部分 微环境诱导前列腺癌细胞发生EMT并形成DTCs的作用机制目的：揭示前列腺癌细胞在体内生长过程中发生EMT并产生DTCs的分子机制。方法：运用antibody array, Protein/DNA array检测PC3, PC3-luc, PC3-luc s1, C4-2B, C4-2B-luc, C4-2B-Iuc s1细胞的差异条件培养上清蛋白表达和核蛋白差异表达转录因子;运用STRING 10.0软件分析其可能的相关通路；通过ELISA和荧光定量RT-PCR验证其差异表达蛋白在PC3, PC3-luc, PC3-luc s1中的表达,Western blot验证核差异表达转录因子,并检测相关重要通路蛋白的表达情况。结果：与亲本细胞相比,MCP-1在PC3-lucs1和C4-2B-lucs1条件培养上清中的表达均有增高;在PC3-lucs1细胞核中,转录因子c-Myb, SP-1表达下调,c-Jun表达上调,而CREB变化不大。总蛋白Western blot检测结果显示：p-Akt, Akt, p-AMPK α, AMPK α, p-mTOR, mTOR, p-p70S6K, p70S6K, p-4E-BP1,4E-BP1蛋白在PC3, PC3-luc, PC3-lucs1中的表达有变化,其中p-mTOR表达下调,p-p70S6K, p-4E-BP1和p-GSK-3β表达上调,总蛋白均不变。结论；EMT的发生,及肿瘤细胞的增殖、转移和血管形成有可能是通过Akt经AP-1调控MCP-1的表达来实现,或经Akt/AMPK α/mTOR信号通路调控所致。第六部分小鼠器官特异性转移模型的建立目的：建立PC3-luc及RM-1-luc小鼠心内注射和胫骨注射转移模型方法：将2×105个PC3-luc和RM-1-luc细胞以心内注射的方式和胫骨注射的方式分别注射于SCID小鼠和C57BL/6J小鼠,每周一次活体成像观察肿瘤转移情况,每周称重两次监测小鼠身体状况。待转移瘤长到一定大小时,将小鼠处死,取出内脏做活成像离体曝光,留取部分肺部转移小鼠做转移瘤体外再培养。结果：PC3-luc细胞建立的心内注射模型小鼠约在4周后开始出现转移,包括肺部转移、肝脏转移和骨转移；PC3-luc细胞建立的胫骨注射模型小鼠在原位生长充满整个腿部及脚部的骨髓腔,并在8周后开始转移到对侧腿部和脚部；RM-1-luc细胞心内注射的模型小鼠约在1周后就出现了全身脏器的转移,包括脑、心脏、肺脏、肝脏、肾脏等,RM-1-luc细胞胫骨注射的模型小鼠不仅在骨髓腔内生长,且约在1周后出现以肺部转移为主的脑转移、心脏转移和肝脏转移等；PC3-luc和RM-1-luc细胞的肺转移细胞株被收集体外再培养。结论：心内注射前列腺癌小鼠模型可发生全身主要脏器的转移及骨转移,而胫骨注射前列腺癌小鼠模型,肿瘤不仅在注射部分的骨髓腔内生长,并可发生远端转移。