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N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor)作为一类谷氨酸受体,与突触可塑性的形成和维持、癫痫、药物成瘾等密切相关。NMDA受体是由多种亚型组成的复合物,其中2B亚基(NR2B)在多种神经病理性痛、炎性痛及药物成瘾等病理过程中有非常重要的作用。Conantokins为天然芋螺多肽的一种亚型,可特异性作用于NMDA受体,是目前唯一一种多肽类NMDA受体拮抗剂。前期本实验室研究表明,conantokins肽具有镇痛作用,其作用与NR2B亚型的特异性选择相关,con-G(conantokin-G)及con-G的一系列突变体能显著抑制吗啡诱导小鼠的纳洛酮戒断跳跃。本课题基于上述前期研究结果,拟进一步开展con-T[M8Q]抑制吗啡镇痛耐受的新功能研究。此外,基于前期对con-T和con-G的结构-功能关系与作用靶点的研究,采用计算机模拟初步确定con-T[M8Q]的结合位点,应用膜片钳技术研究con-T[M8Q]与NMDA受体各亚型的结合活性,确定其与NMDA受体各亚型的结合位点。该工作将对开发新型镇痛多肽、麻醉类镇痛耐药解除剂以及深入阐明conantokins类多肽与NMDA受体的相互作用机制具有重要意义。另,本课题合成新的芋螺多肽。1.采用热板法和醋酸扭体法测痛阈模型,测定了con-T[M8Q]在低剂量范围内(5nmol/kg,10 nmol/kg,20 nmol/kg)对小鼠吗啡镇痛耐受表达的抑制活性,结果表明,con-T[M8Q]显著提高吗啡耐受小鼠的痛阈值和降低扭体次数。2.采用热板法和醋酸扭体法测痛阈模型,测定了con-T[M8Q]在低剂量范围内(5nmol/kg,10 nmol/kg,20 nmol/kg)对小鼠吗啡镇痛耐受发展的抑制活性,结果表明,con-T[M8Q]能显著抑制小鼠吗啡镇痛耐受的发展,抑制活性高于艾芬地尔(Ifenprodil,NMDA受体的小分子化合物类抑制剂)。3.采用小鼠吗啡耐受实验和纳洛酮催促戒断实验,测定了con-T[M8Q]本身的镇痛作用和成瘾性,结果显示con-T[M8Q]无吗啡样成瘾性副作用,其自身的镇痛活性较低。该结果表明con-T[M8Q]对小鼠吗啡耐受的抑制来自于其对NMDA的抑制作用,而非其自身的镇痛作用。4.根据con-T的结构活性关系结果(Y5,Q8,K19等为功能关键氨基酸)以及华中科技大学对conantokins与NMDA受体NR2B亚基相互作用的分子计算,设计了NMDA受体NR2B的可能结合位点,成功制备NR2B亚型质粒并成功表达于HEK293细胞。然后用膜片钳技术初步开展了con-T[M8Q]对NMDA受体NR2B亚基的结合试验。5.实验室已克隆出多种新的芋螺多肽的基因序列,为了后续电生理实验的需要,我们合成两个芋螺多肽Bt3.1和Im IIA。